转甲状腺素蛋白Val30Ala突变在家族型淀粉样多神经病中的作用机制研究

家族型淀粉样多神经病( Familial amyloid polyneuropathy, FAP )是一种常染色体显性遗传病，主要由转甲状腺素蛋白( transthyretin, TTR )基因突变引起，在组织间隙产生TTR淀粉样沉淀，损伤机体的各组织器官。已报道有80种以上的TTR基因突变与FAP发生相关。我国对FAP的研究起步晚，只有几个散发病例和家系的报道。最近我们发现了一个中国五代FAP家系，遗传分析表明其FAP患者的TTR为V30A杂合突变，一种罕见型TTR突变。在完成了对家系患者的临床资料收集和病理检查的基础上，本项目拟通过分析V30A突变对血清TTR和重组TTR稳定性和淀粉样物质形成的影响，结合V30A TTR的分子动力学模拟，揭示TTR V30A在FAP中的作用，为治疗FAP提供理论数据。

家族性淀粉样多神经病（Familial amyloidotic polyneuropathy，FAP）是一种罕见的常染色体显性遗传病。临床表现为在全身组织间隙中出现淀粉样物质沉着，早期主要损伤末梢神经和植物神经，晚期可累及许多内脏器官，导致死亡。目前认为转甲状腺素蛋白（Transthyretin，TTR）基因的点突变是导致FAP的主要原因。2009年我们发现了一个五代FAP家系，基因测序的结果表明患病者皆携带TTR V30A的突变位点，免疫组化的研究表明先证者体内不同器官中存在TTR淀粉样物质的沉积。我们推测V30A突变可能是导致此家系致病的主要原因，但是其致病机制还未见报道。我们从TTR V30A突变体的结构稳定性和体外细胞毒作用两方面探讨了此突变致病的原因。首先在体外表达和纯化了TTR野生型，TTR V30A和广泛分布的TTR V30M。分别测定了它们在PH或尿素压力下蛋白的四级，三级，二级结构的稳定性和形成淀粉样物质的能力。结果表明V30A突变导致TTR蛋白四级，三级，二级结构动力学和热动力学稳定性明显地下降，促进淀粉样物质的形成。等温微量热滴定法的结果证实V30A突变后降低了TTR与配体氟芬酸的结合能力。计算机模拟的结果也证实V30A突变后使TTR的亲水表面面积和回旋半径明显升高，说明此突变导致TTR结构更加松散，进一步证实V30A突变导致TTR蛋白稳定性下降。是否TTR V30A突变体的稳定性下降与其神经毒性相关？体外的研究结果表明V30A突变增加TTR对神经母细胞瘤IMR-32细胞的杀伤作用，并且伴随着活性氧水平的增加，DNA损伤标记蛋白γH2AX的表达，凋亡标记蛋白Caspase 3和PARP的裂解，及自噬标记蛋白Beclin1的表达。综上所述，我们的研究结果显示，V30A突变使TTR的四级，三级和二级结构的稳定性下降，促进淀粉样物质的形成，增加对神经细胞的杀伤作用，可能是导致此FAP家系致病的主要原因。此研究不仅首次揭示了TTR V30A突变引起FAP的致病机制，而且为将来开发稳定TTR突变体的小分子抑制剂提供了理论依据。

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