低氧条件下Claudin-5参与自噬对血脑屏障的保护机制研究

The structural and functional damage of the blood-brain barrier (BBB) is a progressive process, with an initial injury resulting from ischemia and its therapy of thrombolytic reperfusion. During ischemic stroke, the tight junction between endothelial cells degrades and causes a leaky endothelial barrier in the ischemic brain region, where neurotoxicants and leucocytes may easily invade into the central nervous system (CNS), causing cerebral edema and other CNS complications. In our primary study, we found that autophagy can affect the cytoplasmic and membranous re-distribution of Claudin-5 in cerebral endothelial cells post-endocytosis under the hypoxic induction, therefore protects the breakdown of BBB at the early hypoxic treatment stage. Furthermore, it was found that the expression of Claudin-5 in endothelial cells could reversely mediate the initiation of autophagy during the early hypoxic induction. In this project, we will combine in vitro endothelial cells and in vivo zebrafish studies to find out: (1) the spatio-temporal regulation of autophagy on the endocytosis and degradation of Claudin-5; (2) BBB permeability change after hypoxic induction. We will further focus on and identify the molecular mechanisms of how Claudin-5 affects the autophagy after early hypoxic treatment. Our study will clarify the protective role of Claudin-5 in autophagy on the regulation of BBB function under hypoxia and may shed new light on the treatment of ischemic stroke.

缺血性脑卒中常常会造成血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）结构和功能损伤，导致脑血管内皮细胞层通透性增大，神经毒性因子等入侵脑组织。脑卒中后BBB损伤机理迄今尚不完全明确。我们前期构建了体外缺血缺氧诱导的BBB损伤模型，发现缺氧早期脑血管内皮细胞自噬能影响细胞膜上紧密连接蛋白Claudin-5 (Cldn5)在细胞中的重分布和降解，从而缓解BBB紧密性被快速破坏；我们还发现内皮细胞中Cldn5表达与否能影响低氧诱导早期自噬发生。本项目拟利用多种脑血管内皮细胞、基因敲除斑马鱼等探索低氧诱导各时段自噬影响Cldn5重分布和降解的时空规律，及其缓解BBB结构和功能破坏的保护机制；并重点研究低氧诱导早期Cldn5影响自噬发生的分子机理，揭示其在自噬发生中的具体作用。我们希望通过此研究阐明Cldn5参与自噬对BBB的保护机制，为缺血性脑卒中等疾病的治疗提供新的靶点及理论依据。

缺血性脑卒中常常会造成血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）结构和功能损伤，导致脑血管内皮细胞层通透性增大，神经毒性因子等入侵脑组织。脑卒中后BBB被损伤以及机体自身对BBB损伤的应急保护机制尚不完全清楚。在脑卒中引起的局部脑组织缺血缺氧及缺血再灌注后，内皮损伤一直被认为是引发BBB破坏的重要因素。因此，卒中后机体对BBB的保护机制及BBB在损伤后的修复机理也逐渐成为探索卒中治疗策略的热点之一。在本项目的研究中，项目组利用临床卒中样品并结合小鼠、斑马鱼脑缺血、缺氧模型研究发现：卒中引起的脑血管内皮细胞缺血缺氧损伤后，膜蛋白Claudin-5被胞膜窖内吞至胞浆是BBB损伤的主要因素。同时，内皮细胞自噬能及时清除胞浆中因低氧损伤而异常聚集的蛋白（如Claudin-5等）来降低细胞毒性，并通过对胞膜窖蛋白caveolin-1的快速降解来进一步延缓细胞膜上Claudin-5被内吞，从而维持和应急保护BBB功能在卒中早期（6-12 h）免遭急剧破坏（Autophagy, 2020；Front. Physiol., 2019）。同时，对内皮细胞低氧损伤后不同时间点紧密连接蛋白家族成员的命运进行分析后发现：Claudin-5是低氧损伤后（6-12 h）首先被从细胞膜上内吞的蛋白，Occludin和ZO-1等在低氧损伤12-24 h内才发生被内吞和降解。因此，我们进一步构建了Claudin-5特异性敲除的稳定细胞系，通过低氧处理后发现，血管内皮细胞膜上Claudin-5的表达能决定低氧早期细胞自噬的发生。敲除Claudin-5后，低氧早期自噬不能被激活。深入机制研究揭示，Claudin-5缺失后内皮细胞对低氧刺激产生耐受，抑制HIF-1a和iNOS等的激活，从而延缓了自噬的激活（Front. Physiol., 2021）。该项目的系列研究成果详细阐明了卒中所引起的脑组织局部缺血缺氧环境下BBB被损伤的主要分子机制，同时系统地揭示了内皮细胞自噬在缺氧早期对BBB的应急保护机理。研究结果也启示：临床上是否将脑血管内皮细胞自噬的适当增强作为脑卒中早期治疗的潜在方案。.通过本项目的资助，共发表SCI论文9篇，代表性论文发表于Autophagy, Protein Cell等学术期刊上；获得授权发明专利和实用新型专利各一件。在人才培养方面，培养硕士生3名、博士生2名。

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