一种新型λ-卡拉胶酶的基因克隆、结构与功能关系及作用机制研究

卡拉胶是以1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸多糖，主要有κ-型、ι-型和λ-型三种卡拉胶，其二糖单元分别含有1个、2个、3个硫酸基。卡拉胶酶是一种特异性地水解卡拉胶的β-1,4糖苷键的糖水解酶。已知的κ-卡拉胶酶均属于糖水解酶16家族，其降解κ-卡拉胶的机制为保持型，主产物为硫酸κ-新卡拉二糖和硫酸κ-新卡拉四糖。ι-卡拉胶酶归属于GH82家族，降解ι-卡拉胶的机制为转变型，主产物为硫酸ι-新卡拉四糖。迄今国际共享数据库中λ-卡拉胶酶只有一个，降解λ-卡拉胶的机制为转变型，水解主产物为四糖和六糖。在本项目中，项目组克隆了一种新型λ-卡拉胶酶CglA的全长编码基因，cglA全长1023 bp，编码一个340 aa的蛋白质，理论分子量为36.3 kDa。序列相似性分析表明，该酶与已知酶序列相似性低，属于一个新的糖水解酶家族。CglA最适温度和pH为40 C和pH7.6，在30 C下和pH6-9比较稳定，降解λ-卡拉胶的最终产物为二糖和四糖。以系列λ-卡拉胶寡糖为底物，利用位点作图法确定了酶的催化腔有8个底物结合位点（-4~+4），最小降解底物为λ-卡拉六糖，六糖在催化腔中占据-4~+2位点。CglA不同时间降解产物的1H-NMR谱图结果表明，在反应初期G2SrH1α和D2S6SnrH4的质子峰积分面积相等，随着水解反应的进一步进行，它们的峰值不断增加，但是G2SrH1α增加的速度要小于D2S6SnrH4α增加的速度，推测可能是α异头碳变旋为β异头碳构象，因此该酶的催化机制应当是倒位型。综上所述，λ-卡拉胶酶CglA是一种结构和功能全新的糖水解酶，代表了糖水解酶的一个新家族。