灵芝三萜在常染色体显性遗传多囊肾病中抑制肾脏囊泡发生和发展的作用机制研究

Ganoderma triterpenes (GT) are the main active components in ganoderma lucidum. We found GT inhibit renal cysts significantly in autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) in our previous work, but the researches about the involved mechanisms are not sufficient. ADPKD has many similarities with tumors and there are few effective drugs or therapies to treat ADPKD. The research results of GT in anti-tumors showed us that GT play an important role in delaying cell cycle, inhibiting cell proliferation, cell apoptosis and tissue fibrosis, and regulating intracellular cAMP levels. These changes are also very critical in renal cyst formation and development. Therefore, we predict that GT inhibit renal cysts by inhibiting cell proliferation, cell apoptosis, extracellular matrix remodeling and cyst fluid secretion. In this project, we will further explore how GT inhibit ADPKD progress by in vitro cell experiments and in vivo ADPKD animals. We will carry out multi-level system researches including detection in tissue pathological changes, cell states, marker protein expression and key signaling pathway levels. The aim of this project is to investigate new targets of GT in ADPKD, and provide more theoretical basis and experimental evidence for GT being a new drug to treat ADPKD.

灵芝三萜是灵芝中主要的活性成分之一，我们的前期研究结果发现灵芝三萜对常染色体显性遗传多囊肾病（ADPKD）肾脏囊泡具有明显的抑制作用，但相关机制研究尚不完善。ADPKD与肿瘤之间具有一定的相似性，目前尚无理想的治疗药物。灵芝三萜抗肿瘤的大量研究结果显示，其能够抑制细胞周期，延缓细胞增殖，改善细胞凋亡水平，抑制组织纤维化，调节细胞中cAMP水平等，这些过程在ADPKD发生和发展过程中也十分关键。因此，我们提出假设，灵芝三萜抑制肾脏囊泡发展的作用机制可能涉及其延缓细胞周期，抑制细胞凋亡，缓解细胞外基质重塑和组织纤维化的发生，抑制囊液分泌等作用。本项目将分别在细胞和动物水平，通过多种体内、外实验，细胞状态分析，标志蛋白检测等，开展多层次的系统研究，进一步探究灵芝三萜抑制肾脏囊泡的作用机制，为发现灵芝三萜新的作用靶点和进一步促进其成为治疗ADPKD的新型药物，提供理论基础和实验依据。

常染色体显性遗传多囊肾病ADPKD是一种常见的单基因遗传病，主要临床表现为双侧肾脏多发性进行性增大的充液囊泡，伴随肾脏纤维化，最终发展为终末期肾病，威胁患者的生命。唯一被批准应用于治疗ADPKD，被证实对肾脏囊泡的发展具有一定抑制作用的药物为托伐普坦，但其具有肝毒性，影响水盐代谢等不良反应，药物价格高，因此筛选其他的特异性抑制肾脏囊泡发展的潜在化合物对于ADPKD的治疗具有重要意义。在本课题中，我们主要研究Notch信号通路是否参与ADPKD的发生和发展，通过调节Notch信号通路能否对ADPKD产生一定的干预作用。我们首先对野生型小鼠和ADPKD小鼠的肾脏进行转录组分析，并采用Western Blot进行验证，发现在ADPKD肾脏中，存在Notch信号的过度激活。之后我们选择了两种γ分泌酶的抑制剂DAPT和LY-411575去下调Notch信号通路，使用不同的ADPKD的体外及体内模型，验证药物对肾脏囊泡的影响。结果发现，在MDCK囊泡模型，胚胎肾囊泡模型及ADPKD小鼠模型中，DAPT和LY均能显著抑制肾脏囊泡的发展。之后我们分析药物的作用机制，由于细胞增殖对于肾脏囊泡的发展具有重要作用，Notch信号通路在其他疾病中被证实对细胞增殖具有一定的调节作用。因此，我们采用MDCK细胞集落实验以及小鼠肾脏组织PCNA免疫组化染色实验，发现DAPT和LY能够显著抑制细胞增殖。之后我们进行Western Blot实验，研究其抑制细胞增殖的分子机制，结果发现DAPT和LY在小鼠肾脏组织中，显著下调HES1的表达，促进PTEN表达，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，这可能是其下调细胞增殖，抑制肾脏囊泡的具体机制。为了验证PTEN分子的关键作用，我们在MDCK细胞中，对PTEN分子进行敲降，再进行MDCK细胞集落实验和MDCK囊泡实验，发现DAPT和LY对细胞增殖的影响，对囊泡生长的影响减弱了，说明药物确实是通过PTEN发挥作用。以上，我们获得结论，Notch信号通路通过影响PTEN/PI3K/Akt/mTOR轴，影响细胞增殖，参与ADPKD的发生和发展，使用γ分泌酶的抑制剂下调Notch信号通路对ADPKD具有一定的治疗作用。

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