靶向识别VWF且规避ADAMTS13自身抗体的新型酶的研制及其功能研究
结题报告
批准号:
81900141
项目类别:
青年科学基金项目
资助金额:
20.0 万元
负责人:
张露璐
依托单位:
学科分类:
H0805.出血、凝血、纤溶与血栓
结题年份:
2022
批准年份:
2019
项目状态:
已结题
项目参与者:
--
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中文摘要
血栓性血小板减少性紫癜(TTP)是ADAMTS13酶活性缺乏无法降解超大分子VWF(UL-VWF)所引发的急性血栓性微血管疾病,其病死率高达90%以上。大多TTP是由针对ADAMTS13酶的自身抗体所致,目前重组ADAMTS13(rADAMTS13)替代治疗对这类获得性TTP效果不佳甚至无效,急需新的治疗策略。我们前期成功制备了一株高亲和力抗VWFα5亚单位的单克隆抗体(SZ-179)。本项目拟在前期研究基础上通过生物信息学分析筛选ADAMTS13金属蛋白酶区与SZ-179单链抗体的最佳融合方式并据此构建真核表达质粒,利用HeLa细胞表达融合蛋白,以rADAMTS13为标准品从不同层面评估新型融合酶的酶促动力学。以期获得高效靶向识别VWF且规避ADAMTS13自身抗体的新型融合酶。力求为今后获得性TTP动物模型的在体实验及临床前研究提供理论依据,为获得性TTP的治疗新策略提供理论思路。
英文摘要
Deficiency of plasma ADAMTS13 activity caused by autoantibodies leads to the persistence of highly adhesive ultra-large VWF(UL-VWF), resulting in acquired thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), a microangiopathy characterized by diffusive platelet thrombi in the microcirculation. With a mortality rate over 90%, most acquired TTP patients are insensitive to recombinant ADAMTS13 (rADAMTS13), the mainstay replacement therapy for TTP. Therefore, how to reconstruct ADAMTS13 is a promising treatment option for TTP, which maintains enzyme activity and at the same time is resistant to neutralizing antibodies. We have successfully developed a monoclonal antibody (mAb) against the C-terminal α-helix of human VWFA2 domain (SZ-179), it was found to have high affinity for native VWF. Based on our previous studies, we propose to design a fusion protein with SZ-179 single-chain variable fragments (ScFv) and the metalloprotease domain of ADAMTS13 by bioinformatics technology. An eukaryotic expression system will be used for stable expression of a fusion protein with C-terminal His-tag in HeLa cells. ADAMTS13 enzyme activity and pharmacokinetics of the novel fusion enzyme will be analyzed. This novel fusion enzyme would specifically recognize VWF but resistant to neutralization of anti-ADAMTS13 autoantibodies. This study will provide a theoretical basis for in vivo experiments on acquired TTP animal model and preclinical studies. It may lead to novel effective therapies for acquired TTP.
【研究背景】.血栓性血小板减少性紫癜(TTP)是ADAMTS13酶活性缺乏无法降解超大分子VWF(UL-VWF) 所引发的急性血栓性微血管疾病,其病死率高达90%以上。大多TTP是由针对ADAMTS13酶的自身抗体所致,目前重组ADAMTS13(rADAMTS13)替代治疗对这类获得性TTP效果不佳甚至无效,急需新的治疗策略。.【主要研究内容】.在前期研究基础上通过生物信息学分析筛选ADAMTS13金属蛋白酶区与SZ-179单链抗体的最佳融合方式并据此构建真核表达质粒,真核表达融合蛋白,以rADAMTS13为标准品从不同层面评估新型融合酶的酶促动力学。以期获得高效靶向识别VWF且规避ADAMTS13自身抗体的新型融合酶。.【重要结果及关键数据】.1)对SZ-179单链抗体生物学特性进行检测,结果显示scFv-VH-VL与VWFα5结合效价可达100ng/ml,scFv-VH-VL与pVWF结合效价可达200ng/ml,说明scFv-VH-VL与VWFα5及pVWF均有较强的结合活性。.2)ADAMTS13 M区与SZ-179单链抗体的生物信息学分析及利用HDOCK进行分子对接及评分,将MP-(G4S)3-VL-(G4S)3-VH(Seq2)和MP-A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A-VH-(G4S)3-VL(Seq5)与PDB数据库公布的ADAMTS13模型进行比对,结果显示M区的折叠均正确,酶的活性中心均不受影响,且不影响单链抗体的构象。与VWF1605-1622进行对接时,Seq2和Seq5的评分为-200.04 和-191.18,且与活性位点呈现了相互接触,说明它们与VWF1605-1622相互作用的能力强。与VWFfull进行对接时,Seq5的评分为-203.43,且与活性位点呈现了相互接触,说明它与VWFfull相互作用的能力强。.3)成功构建融合酶重组真核表达载体并分析蛋白序列,HDCHO-S表达系统及HEK-293表达系统中均在细胞裂解液及细胞沉淀中检测有目的蛋白表达。.【科学意义】.为开发对TTP高效、靶向、安全的替代治疗策略提供理论依据。为获得性TTP的治疗新策略提供理论思路,具有转化医学意义。
期刊论文列表
专著列表
科研奖励列表
会议论文列表
专利列表
DOI:10.4274/tjh.galenos.2020.2020.0400
发表时间:2021
期刊:Turkish journal of hematology
影响因子:--
作者:LuLu Zhang;Yu Liu;Yi Gang Guo;Juan Chang;Bo Gao;Zhang Zhi Li;Wei Geng;Pin Hu;Bin Song;Xia Zhang;Chu Cheng Wan
通讯作者:Chu Cheng Wan
N6-Methyladenosine-Related lncRNAs Are Novel Prognostic Markers and Predict the Immune Landscape in Acute Myeloid Leukemia.
N6-甲基腺苷相关 lncRNA 是新型预后标志物,可预测急性髓系白血病的免疫状况
DOI:10.3389/fgene.2022.804614
发表时间:2022
期刊:Frontiers in genetics
影响因子:3.7
作者:
通讯作者:
Efficacy and safety of plasmapheresis without plasma transfusion tandem with chemotherapy to treat multiple myeloma
不输血浆血浆置换联合化疗治疗多发性骨髓瘤的疗效和安全性
DOI:10.1080/16078454.2022.2140980
发表时间:2022-11
期刊:Hematology
影响因子:1.9
作者:Yigang Guo;Lulu Zhang;Rongyao Zhang;Meiling Zhou;Xu Chen;Chucheng Wan;Ping Hu;Yuanyuan He;Hua Jiang;Wei Geng;Weixing Zhang;Fariha Kanwal;Muhammad Fayyaz ur Rehman;Zhangzhi Li
通讯作者:Zhangzhi Li
DOI:--
发表时间:2022
期刊:临床内科杂志
影响因子:--
作者:郭毅刚;张露璐;郭毅刚;胡平;龙志国;张荣耀;周梅玲;陈旭;万楚成
通讯作者:万楚成
DOI:10.1016/j.taap.2021.115468
发表时间:2021-02
期刊:Toxicology and applied pharmacology
影响因子:3.8
作者:T. Zheng;Qibin Wang;F. Bian;Yan Zhao;Wei-dong Ma;Yonghong Zhang;Wei Lu;Pan Lei;Lulu Zhang;Xincai Hao;Li Chen
通讯作者:T. Zheng;Qibin Wang;F. Bian;Yan Zhao;Wei-dong Ma;Yonghong Zhang;Wei Lu;Pan Lei;Lulu Zhang;Xincai Hao;Li Chen
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