汉黄芩素诱导免疫性肿瘤细胞死亡的作用机理研究

增强肿瘤细胞的免疫原性，提高抗原递呈细胞的识别和呈递效率，激发机体的抗肿瘤免疫应答，是避免肿瘤逃逸免疫系统监视的重要策略。本课题组前期研究表明，汉黄芩素可显著增强肿瘤细胞的免疫原性，诱导免疫性肿瘤细胞死亡（ICCD）。本项目通过cDNA微阵列和二维电泳－SELDI-TOF-MS技术研究发现，汉黄芩素可以显著上调对化疗药物不敏感的人低分化胃癌MKN45细胞的CRT、HMGB1、Annexin A1等肿瘤免疫相关蛋白的表达，并呈现明显的剂量依赖性。进一步应用细胞免疫荧光结合激光共聚焦实验发现，给予汉黄芩素可以诱导CRT从胞浆向细胞膜分布。应用Western-blotting检测证实汉黄芩素可以显著诱导CRT、Annexin A1、和p22向细胞膜转位，增加肿瘤细胞的免疫原性，并且AKT抑制剂和mTOR抑制剂可以阻断CRT的膜转位，提示PI3K/AKT/mTOR通路参与CRT膜转位的调控。汉黄芩素可以促进MFC细胞释放ATP和HMGB1。汉黄芩素作用MFC细胞可以显著诱导ROS的产生，并且NAC可以抑制ROS的产生。同时，汉黄芩素可以显著诱导内质网应激，导致PERK和PKR磷酸化，并且激活PI3K/AKT/mTORC1通路，上述过程可以被NAC阻断，提示ROS是上有信号分子。进一步研究发现，ROS可导致PERK和PKR磷酸化，激活PI3K/AKT/mTORC1。骨髓来源的DC细胞（MoDCs）和MFC细胞混合培养，结果显示随着汉黄芩素浓度的增加，DC细胞吞噬的肿瘤细胞逐步增加，提示汉黄芩素可以增强肿瘤细胞的免疫原性，促进DC细胞对肿瘤细胞的设别和吞噬。体内试验进一步证实，汉黄芩素作用后的MFC细胞接种小鼠，可以对第二次接种在对侧腋下的MFC细胞的生长产生显著的抑制作用。综上所述，本项目应用蛋白质组学、IP、siRNA等手段，分析汉黄芩素促进钙网蛋白（CRT）和Annexin A1膜转位以及诱导HMGB1、HSP90/70和ATP释放的调控靶点，阐明其相关信号转导通路；2）应用siRNA等技术，从分子、细胞和整体水平系统研究CRT、Annexin A1和HMGB1等分子在诱导DC细胞对肿瘤细胞的识别、抗原递呈以及CTL细胞介导的免疫应答过程中的作用。通过上述研究，阐明汉黄芩素增强肿瘤细胞免疫原性，诱导ICCD的确切作用机制，为新药研发和制定合理的临床肿瘤综合治疗方案提供理论