小G蛋白cdc42及下游效应基因维持贝壳发育区细胞边界的机制研究

Molluscan shells are crucial in understanding the interaction between mollusks and the changing marine environment. However, the molecular mechanisms underlying molluscan larval shell development remains unclear. We identified several shell-formation genes in the past several years, and further identified three different cell groups in the shell field of molluscan gastrula based on the distinct expression patterns of different shell-formation genes. These results indicate that the molluscan development involves a canonical developmental issue, that is, the compartment boundary. Maintaining the boundary would be essential to ensure correct shell development. Furthermore, we proved that the GTPase cdc42 functioned in boundary maintenance of the shell field. However, the downstream effector genes of cdc42 remain unclear. In this project, we aim to study the mechanisms underlying the boundary maintenance in representative molluscan species such as limpet and oyster. In particular, we will attempt to reveal the roles of cdc42 in maintaining compartment boundary and identify the downstream effector genes, and elucidate the underlying mechanisms that the genes mediate boundary maintenance. The results will contribute to construct a gene network that underlies molluscan shell development comprising cdc42 and downstream effector genes. The expected results of the project will enrich the knowledge of molluscan shell development, which will provide fundamental support to understand the mechanisms underlying molluscan population maintenance and how mollusks interact with the changing marine environment.

贝壳是研究贝类和海洋环境相互作用的关键环节，然而其发育机制尚不清晰。申请人近年来鉴定了多种贝壳发育基因，并基于基因共表达关系从早期贝壳发育区鉴定了三种不同的细胞群。这些结果使我们将贝壳发育归类到经典的发育生物学问题，即细胞边界问题。正确维持细胞群之间的细胞边界是保证贝壳正常发育的关键。前期研究中我们进一步证实小G蛋白cdc42调控了这些细胞边界，然而其下游效应基因及内在机制尚不清楚。本项目拟立足前期研究基础，以笠贝、牡蛎等代表性海洋贝类为研究材料，综合利用现代分子生物学手段解析贝壳发育区细胞边界的维持机制。具体而言，包括阐明cdc42在边界维持中的功能及下游的效应基因，解析cdc42对效应基因的调控关系以及效应基因维持细胞边界的分子机制，最终构建一个由多个基因构成的贝壳早期发育基因网络。预期研究成果将提升对贝壳发育机制的认知，为深入理解贝类种群维持及与海洋环境的相互关系提供基础支持。

本项目聚焦贝壳早期发育机制研究，致力于系统解析小G蛋白Cdc42及其效应分子NM II及F-actin在贝壳早期发育阶段的功能。项目研究结果表明，长牡蛎和笠贝等代表性贝类的早期贝壳发育区即有上述分子的聚集，且在贝壳形成区外缘形成明显的细胞边界，提示这些分子在贝壳早期发育中发挥功能。抑制Cdc42功能后，贝壳形成区形态明显异常，包括细胞不能正常拉长并变为鹅颈形，中心区域不能内陷等，同时其下游效应分子NM II及F-actin的聚集受到干扰，尤其是F-actin的聚集几乎消失，细胞边界难以辨认。之后的发育中，初生贝壳不能形成。在鉴定了数个贝壳发育基因的基础上，利用基因表达数据研究了多个细胞群体的发育情况，结果表明，抑制Cdc42不影响细胞的分化，但导致贝壳发育区细胞不能正常重排到背部。抑制NM II功能后，幼虫表现出与抑制Cdc42相同的表型，且其抑制效应甚至延伸到面盘幼虫时期，导致面盘幼虫贝壳缺失。上述结果表明，Cdc42通过调控NM II及F-actin参与贝壳形成区的形态建成过程，包括细胞从侧面重排至背部、拉长并变形为鹅颈形、中心区域内陷，最终形成“玫瑰花样”的成熟贝壳形成区。同时，Cdc42及效应分子还直接或间接参与了之后初生贝壳的形成，并对后续贝壳的生长发育产生了持久的影响。上述研究结果从不同的通路节点系统阐述了小G蛋白Cdc42及其效应分子在贝壳形成区的形态建成及幼虫贝壳形成和生长发育中的功能，并揭示了Cdc42对效应分子的调控功能，发展了贝类贝壳发育机制理论。值得指出的是，Cdc42及相关分子可能参与贝壳发育这一现象为项目负责人团队在前期研究中发现并报道，相关假说也为团队独立提出，并经由本项目的研究进一步证实。因此，本项目基于前期研究中所发现的新现象开展了深入研究，取得了重要的新认知，具备鲜明的原创性，其研究结果展示了贝壳发育过程中的一个全新方面，对于深入理解贝类和贝壳早期发育的模式具有重要意义，且可能对解析全球环境变化对贝类的影响有基础支持作用。

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