基于3D打印的基因激活和整合素介导血管化长段骨修复材料研究

Long bone implants cause serious necrosis due to the lack of inner vascularization in clinical treatment. To address this issue, the study on a vascularized bone repair material for long bone defect should be extensively explored. Vascularized bone regeneration is a complicated systematic project that refers to three factors including materials, cells and growth factors. Nonetheless, most of current works are unable to effectively integrate these three factors in one system. As a result, the ideal repairing outcome cannot come true. This proposal is suggested to rely on a previous research progress of the applicant on using 3D printed porous scaffold to promote vascular bone regeneration, and attempts to combine a reconstructed plasmid to locally controlled release vascular endothelial growth factor (VEGF) with an intelligent material to locally recruit vascular endothelial cells (VECs) into one system through further molecular design, and eventually dissolve the aforementioned problem. The main contents of this proposal involve: i) Design and construction of vascularized bone repairing materials; ii) In vitro and in vivo evaluation of new designed materials; iii) Regulatory pathway and role of vascularized bone repairing materials on both bone regeneration and vascular regeneration; Through the study on specific and crucial scientific questions, we will shed light on molecular mechanism and regulatory role of vascularized bone repairing materials on enhancing bone regeneration and elevating vascular regeneration, and establish a vital academic foundation for a new generation of vascularized bone materials applied on long bone defect.

临床上长段骨移植材料因其内部血管化不足而导致坏死现象异常严重，如何实现血管化长段骨修复材料研究是攻克该瓶颈的关键。血管化骨再生是一个复杂的系统工程，涉及到材料、细胞和生长因子三个因素。然而当前大多数研究均无法有效整合三因素于一体，从而导致其修复效果不甚理想。本课题将基于申请人前期在3D打印多孔支架促进血管化骨再生的基础上，通过分子设计将可原位控制释放血管内皮生长因子（VEGF）的重组质粒和原位募集血管内皮细胞（VECs）的智能材料组合成一个体系，为破解上述难题提供了可能。主要研究内容包括：血管化骨修复材料的设计与构建；新材料的体外评价与体内骨缺损修复再生；材料介导成骨分化和成血管分化作用途径及调控规律研究等；通过上述具体和关键科学问题研究，获得对血管化骨修复材料促进骨再生和血管再生的分子机制及其调控规律的深刻理解和认识，为发展应用于长段骨缺损修复的新一代血管化骨材料奠定重要

天然骨组织本身是一个高度血管化的组织，具备一定的自我修复能力，但骨损伤超过其临界缺损尺寸后则无法自愈。因此，长段骨缺损是目前临床烝待解决的痛点问题之一。长段骨修复材料往往因其修复体积较大而材料内部新生骨组织血管化不足，从而导致移植骨修复材料内部坏死。因此，本项目基于基因转染材料为依托，设计和构建具有成骨和成血管双重功能的血管化骨再生修复材料体系，解决长段骨缺损修复材料因内部血管化不足而坏死的临床痛点问题，为发展下一代完全骨再生修复材料奠定理论基础。项目执行4年来，主要进行了如下三个方面的研究工作：.（1）本项目制备和筛选多种VEGF基因载体：为了提高VEGF质粒的转染效率及安全性，本项目先后尝试多种基因载体，包括脂质体2000、PEI修饰的介孔二氧化硅以及外泌体。经过系列表征及功能验证，最终选取了生物相容性好、细胞摄取率高的外泌体及外泌体类似物作为VEGF基因的载体。.（2）本项目设计和构建多种血管化骨修复材料体系：基于静电纺丝技术和3D打印技术分别制备SF/PCL混纺膜、CS/PLA同轴电纺膜和PCL多孔支架，并进一步将上述骨修复材料与包裹VEGF质粒的功能外泌体柔性结合形成新型血管化骨修复材料。体外研究表明外泌体及外泌体类似物能被细胞所摄取，ATDC5来源的外泌体具有促进BMSC的成骨分化，并且分泌出VEGF发挥促进成血管的功能。.（3）本项目将新型血管化骨修复材料应用于不同骨缺损动物模型：本项目构建了大鼠桡骨缺损和颅骨缺损模型来评价新型血管化长段骨修复材料的体内再生修复能力。micro-CT、组织切片观察及骨和血管的特异性蛋白的免疫组化染色结果表明：外泌体装载VEGF质粒在缺损原位可控释放，刺激血管重塑，进而加速原位骨缺损修复。.综上所述，通过本项目具体实施，不仅挖掘外泌体这种新型生物活体材料在组织工程应用，而且据此研发出一系列新型基因激活的血管化骨修复材料，为未来包含骨、血管、神经等完全骨再生奠定了坚实的研究基础。

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