Baeyer-Villiger单加氧酶构效关系和分子进化的研究

批准号:
31070718
项目类别:
面上项目
资助金额:
35.0 万元
负责人:
吴胜
依托单位:
学科分类:
C0505.蛋白质、多肽与酶生物化学
结题年份:
2013
批准年份:
2010
项目状态:
已结题
项目参与者:
王建军、闵聪、王佳宜、杨敏、吴亦菲
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中文摘要
Baeyer-Villiger单加氧酶是一类重要的生物催化剂,可用来制备商业价值很高的手性酯和内酯化合物。本项目通过Induced-Fit docking和生物信息学分析,鉴定在Baeyer-Villiger单加氧酶的底物结合口袋中存在一个非常罕见的,由五个连续保守氨基酸残基组成的Wall结构。拟通过丙氨酸扫描突变和缺失突变,从正反两方面鉴定Wall结构的功能,确定其在底物识别、对映体选择性、区位选择性以及结构稳定性方面的作用。同时,通过分子动力学模拟揭示突变效应的结构和动力学基础。结合上述结果,对Wall结构中关键氨基酸残基进行饱和突变,构建突变文库,通过气相色谱筛选底物谱扩展,催化性能和立体选择性提高的突变酶,为以后的工业化应用奠定基础。本项目以结构研究为基础,组合理性化设计和定向进化的分子进化策略具有广泛的适用性,研究结果具有理论和实际双重价值。
英文摘要
通过对Phenylacetone monooxygenase为代表的Baeyer-Villiger单加氧酶构效关系的研究获得以下研究结果:.1、.通过对PAMO酶活性中心一段由五个氨基酸组成的Wall结构的研究,发现其中G388位点突变为任何其它氨基酸都会导致该酶彻底丧失Baeyer-Villiger氧化活力(C-C活化),而获得一种全新的催化活力即C-H键活化,生成C-OH。同位素标记实验证明,突变酶实际上变成一种环氧化物酶,催化羰基化合物烯醇互变中的双键氧化生成环氧化物中间体,后者自发开环,脱水生成羟化产物。并进一步证明上述发现在Bayer-Villiger单加氧酶中具有普遍性。.2、.通过蛋白质工程对PAMO活性中心的一段alpha螺旋突变分析获得一对具有对映互补功能的突变酶,但催化活性低;通过代谢工程改造大肠杆菌的糖代谢途径,使细胞内NADPH的供应力提高,结果导致细胞的催化活力大幅提高。该研究提供了一种通过组合蛋白质工程和代谢工程设计高效生物催化剂的方法。.3、.通过对PAMO中不保守的HingeI研究,发现其中L153位点是控制该酶催化不对称氧化反应对映体选择性的决定性因素。
专著列表
科研奖励列表
会议论文列表
专利列表
Y-内酰胺酶趋异进化的分子机制研究
- 批准号:31570077
- 项目类别:面上项目
- 资助金额:65.0万元
- 批准年份:2015
- 负责人:吴胜
- 依托单位:
国内基金
海外基金
