兴奋性离子型谷氨酸受体的三维结构及门控开放机制

NMDA receptors are glutamate-gated, calcium-permeable ion channels that are essential mediators of synaptic transmission in the brain. They play fundamental roles in brain development and function and underpin nearly all aspects of learning and memory. Functional NMDA receptors assemble as either di-heterotetramers or tri-heterotetramers that associate two obligatory GluN1 and two alternative copies of GluN2 (2A-2D) subunits, the later GluN2 subunits have been proved to be the contributing determinants for the biophysical and pharmacological heterogeneity in vivo. The function of the di-heteromeric receptors have been widely studies in the past three decades, while structural basis and functional properties of the tri-heteromeric receptors are poorly understood. Here, our proposed research plan is to generate knock-in mouse lines carrying two different tags at the C-terminus of the GluN2A and GluN2B subunits. By performing two-step purification, we aim at isolating the pure tri-heteromeric GluN1/GluN2A/GluN2B proteins from the native tissue. Subsequently, single-particle cryo electron microscopy will be performed to resolve the three-dimensional structures of the tri-heteromeric receptor at various conformations. Meanwhile, functional assays will also be carried out to assess the gating mechanism and pharmacological properties of these tri-heteromers. Such efforts may allow us to uncover the structural basis and molecular composition of the tri-heteromerc NMDA receptors that play distinguish roles in vivo.

NMDA受体是一类广泛存在于大脑兴奋性突触中的离子型谷氨酸受体。对钙离子的高通透性，使NMDA受体在突触可塑性中具有关键作用，是学习与记忆的重要分子基础。NMDA受体因其亚基的多样性，在大脑不同区域分别由不同亚单位组成二异或三异的四聚体（由两个必需GluN1和两个可变GluN2A-2D亚基组成）。当前研究主要集中在二异四聚体，而对三异四聚体的结构及功能则知之甚少。本研究拟构建携带不同标签的基因敲入小鼠，提取纯化前脑的三异四聚体GluN1/GluN2A/GluN2B蛋白，借助单颗粒助冷冻电镜解析三异四聚体的拓扑组成及三维结构。同时，利用体外功能性实验，探索三异四聚体受体的门控调控机制及神经药理学新特征。解析这些不同异聚体的分子组成及三维结构，有利于我们深入了解离子型谷氨酸受体的在体生理学功能。

NMDA受体是一类广泛存在于大脑兴奋性突触中的离子型谷氨酸受体，其对钙离子具有高通透性，在突触可塑性中具有重要作用。NMDA 受体功能异常可引起一系列中枢神经系统疾病，包括抑郁症、中风、慢性疼痛、精神分裂症及阿尔兹海默症等，NMDA受体是当前最热门的药物设计靶点之一。我们团队结合电生理学、神经药理学、光遗传学和结构生物学等实验技术，系统研究NMDA受体的三维结构、动态构象、门控机制及药理学调控机制。. 2018年，我们解析了首个人源GluN1/GluN2A亚型NMDA受体的三维结构。通过比较pH 7.8和pH 6.3的结构差异，证明了质子感受器主要存在GluN2A亚基的N末端结构域，揭示了质子感受器对离子通道的变构调节机制（Zhang et al., Cell Rep. 2018）。团队开发了基于定量赖氨酸反应性变化的受体结构调节机制质谱分析方法，实现了研究小分子/受体之间的互作机制（Zhou et al., Chem Commun. 2019）。2021年，研究团队又解析了一系列人源GluN1/GluN2A亚型与不同小分子化合物结合的高分辨率蛋白质冷冻电镜结构，并探究了受体在不同小分子结合下的门控机制，同时也发现了一个全新的小分子结合位点（Wang et al., Neuron. 2021）。同时，我们团队一直专注NMDA受体的药理学在精神疾病中的作用，尤其是快速起效的新型抗抑郁药氯胺酮，用药几小时内就能改善患者的抑郁症状，甚至减弱患者自杀念头，并且对难治性抑郁症仍有治疗效果。我们通过冷冻电镜技术解析了结合快速抗抑郁药氯胺酮的人源NMDA受体的三维结构，确定了氯胺酮在NMDA受体的结合位点，并进一步通过电生理和分子动态模拟技术，阐明了氯胺酮与NMDA受体结合的结构基础及作用的分子机制（Zhang et al., Nature, 2021）。该研究为基于氯胺酮结构设计新型抗抑郁药的研发提供了理论基础。

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