基于Bump-Hole化学遗传学技术的βIII微管蛋白的功能研究

As the major component of cytoskeleton, microtubule possesses essential physiological and biochemical functions. It is also an important target of anti-tumor drugs. A regulatory mechanism to control the specialization of the microtubule cytoskeleton is the “tubulin code”, which is generated by expression of different α- and β-tubulin isotypes, and by post-translational modifications of tubulin. So far, little is known regarding the impact of specific tubulin isotypes on MT properties and functions. Bump-Hole strategy may address this problem. Firstly, modified vinblastine and mutant human βIII-tubulin (TUBB3) were designed according to the co-crystal structure of microtubule and vinblastine, and one set of bioorthogonal systems were established based on Rosetta ligand docking, in vitro function analysis. Then, wild type and mutant cells were treated with unmodified or modified vinblastine or DMSO. Through analyzing the differences of transcriptomes and proteomes of these treatments, we can further understand the functions of TUBB3, which will provide new ideas and insights in revealing the functions of different tubulin isotypes and deciphering the “tubulin code”.

微管是真核细胞中普遍存在的细胞骨架成分之一，具有重要的生理生化功能，同时也是抗癌药物的重要作用靶点之一。控制细胞中的微管调节机制即为“微管蛋白密码（Tubulin code）”，主要包括同型（Isotype）微管蛋白种类的多样性和微管蛋白翻译后修饰的复杂性。目前对各种同型微管蛋白的功能研究较少。我们以β微管蛋白TUBB3为研究对象，以长春碱为β微管蛋白的配体，采用Bump-Hole化学遗传学技术，从同型微管蛋白种类的多样性方面进行“微管蛋白密码”的解码研究。首先，通过分子对接和体外的功能验证筛选出一对生物正交的突变TUBB3和长春碱类似物，在正常细胞、肿瘤细胞和神经元细胞中建立生物正交体系。然后用这些配体处理细胞，通过比较生物正交体系和非正交体系以及未用配体处理的体系的转录组和蛋白组差异，探究TUBB3参与的生物学过程，系统的揭示TUBB3的功能，为解析“微管蛋白密码”提供新思路和新见解。

微管是真核细胞中普遍存在的细胞骨架成分之一，具有重要的生理生化功能，同时也是抗癌药物的重要作用靶点之一。控制细胞中的微管调节机制即为“微管蛋白密码（Tubulin code）”，主要包括同型（Isotype）微管蛋白种类的多样性和微管蛋白翻译后修饰的复杂性。目前对各种同型微管蛋白的功能研究较少。我们以β微管蛋白TUBB3为研究对象，以长春碱为β微管蛋白的配体，采用Bump-Hole化学遗传学技术，从同型微管蛋白种类的多样性方面进行“微管蛋白密码”的解码研究。.首先我们根据已报道的长春碱和微管蛋白的共晶结构（PDB#5J2T），利用Rosetta计算机模拟确定了长春碱和长春瑞滨的修饰位点（即Bump位点，将长春碱C20’的乙基改造成丁基）和β微管蛋白（TUBB3）氨基酸的突变位点（即Hole位点，L225A），并利用所在实验室发展的一条高效化学合成路线，方便高效地制备了长春碱及本项目所需的类似物VBL-C4和NVB-C5。.通过细胞毒活性实验表明VBL-C4对野生型和L225A突变型人结肠癌细胞HCT-116的IC50分别是1122 nM和6.9 nM，相差162倍；NVB-C5对野生型和L225A突变型人结肠癌细胞HC-T116的IC50分别是1203nM和18.6 nM，相差65倍。免疫荧光成像显示20 nM的VBL-C4和NVB-C5对野生型HCT-116细胞几乎没有影响，但明显抑制L225A突变型HCT116细胞的增殖和微管的聚合。 之后我们成功地在昆虫细胞sf21中表达、纯化得到TUBA1A/TUBB3L225A二聚体。通过体外微管聚合实验，结果表明5 μM的VBL-C4和NVB-C5轻微抑制野生型微管蛋白的聚合，但完全抑制L225A突变型微管蛋白的聚合；0.55 μM的VBL-C4和NVB-C5不抑制野生型微管蛋白的聚合，但抑制L225A突变型微管蛋白的聚合。这样我们在细胞层面上建立了一套生物正交体系，为阐明同型β微管蛋白TUBB3在正常细胞、肿瘤细胞、神经元细胞中的生物功能差异奠定了基础。期望通过比较生物正交体系和非正交体系以及未用配体处理的体系的转录组和蛋白组差异，探究TUBB3参与的生物学过程，系统地揭示TUBB3的生物学功能，为解析“微管蛋白密码”提供新思路和新见解。

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