重组蜘蛛丝蛋白的设计及其分子自组装对生物矿化功能调控的研究

本项目利用基因重组技术，把不同来源的钙结合氨基酸序列分别导入蜘蛛丝蛋白中，通过改变蜘蛛丝的一级结构促进蜘蛛丝蛋白的生物矿化功能，并解明蜘蛛丝蛋白在生物矿化过程中的分子自组装，从而阐明蜘蛛丝蛋白对羟基磷灰石结晶形成、形态结构的调控作用，揭示蛋白质一级结构及其高级结构对生物矿化功能的调控机理。在促进蜘蛛丝蛋白生物矿化功能的同时，进一步阐明蜘蛛丝蛋白结构与功能的关系。.通过生物技术和蛋白质分子自组装对蜘蛛丝蛋白生物矿化功能的研究，为新型蜘蛛丝蛋白的分子设计提供理论依据和思路，拓展蜘蛛丝蛋白在组织工程领域的用途，对学科发展有重要意义。

蜘蛛丝具有高强度、高弹性和高断裂能等性能及其生物组织相容性，是组织工程领域引人注目的一类特殊生物材料，然而，由于蜘蛛不容易人工饲养，加上蜘蛛丝无法象蚕丝一样可以通过蚕茧大量采集，从而极大地制约了蜘蛛丝蛋白在骨组织工程领域的研究应用。天然骨主要是由无机矿物的羟基磷灰石结晶和I型胶原蛋白规则排列而成的复合体， 在生物矿化过程中I型胶原蛋白的COOH对羟基磷灰石结晶的形成起着重要的调控作用。.因此，本项目利用基因重组技术，在蜘蛛丝蛋白的一级结构中导入钙结合氨基酸序列，设计了3种重组丝蛋白蛋白，其一级结构为[GGAGGAAAAAAAAGGAGGAQESQSEQDS]4，[AAAAAAAGGAE]8与[AAAAAAAGGAAKEGDPNQLSKEE]4，以期形成 lamellar结构从而促进蜘蛛丝蛋白的生物矿化功能。通过蛋白表达与纯化，得到上述重组蜘蛛丝蛋白。该重组蜘蛛丝蛋白具有钙离子结合能力，与钙离子结合后，其结构从无规卷曲变成β-sheet折叠结构，在形貌上从纳米棒状变成纳米网络结构，为生物矿化提供平台。重组蜘蛛丝蛋白置于缓冲液1.5SBF模拟体液后，在与钙离子结合作用下，启动生物矿化功能，先是诱导生成纳米针状羟基磷灰石，随着矿化时间增长至5d, 在重组丝蛋白与纳米针状羟基磷灰石的氢键作用下，形成羟基磷灰石微球。因此，重组丝蛋白通过自身的自组装作用下，诱导生成了羟基磷灰石纳米微球。将骨髓间充质干细胞种植在羟基磷灰石纳米微球上，通过7d培养，MTS检测和ALP活性测试均表明羟基磷灰石能够促进细胞的增殖与向成骨细胞的分化。与此同时，将重组丝蛋白与蚕丝蛋白混合做成膜，植入大鼠骨下颌骨骨缺损部位，评价重组丝蛋白对骨的修复重建功能。术后8周，利用显微CT扫描植入修复材料的下颌骨，结果表明：空白对照组与植入普通家蚕丝素蛋白膜的下颌骨存在明显的缺损而植入重组丝蛋白膜的下颌骨缺损基本填满，新生的骨细胞明显增多，说明本项目设计的重组蜘蛛丝蛋白提促进骨组织的再生。.本项目利用基因重组技术与生物矿化功能成功地设计了具有生物矿化功能的重组丝蛋白，该蛋白通过分子自组装调控成了羟基磷灰石微球，从而促进细胞向成骨细胞的分化。动物植入实验表明重组蜘蛛丝蛋白可以提高骨的再生功能，说明本项目设计的重组蜘蛛丝蛋白具有潜在的临床应用前景。

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