基于SDF-1/CXCR4－PI3K/Akt信号通路研究补肾活血法对再生障碍性贫血骨髓MSCs功能的影响

Aplastic anemia (AA) is rooted in kidney deficiency in the traditional Chinese medicine. Most physicians have reached a consensus that kidney-reinforcing method can significantly promote the clinical effect, but it does not efficient to some patients. Our preliminary studys indicated that kidney deficiency and blood stasis is the basic pathogenesis of AA and is widespread in patients with AA, which is similar to the pathogenesis of the AA micro environment in the modern medicine. The quantity and function of MSCs of AA has obvious flaw. The Kidney-reinforcing and blood-activating method can effectively promote the recovery of MSCs' function and improve the marrow microenvironment may be related to its activiting PI3K/Akt signal path. This project will use immunohistochemistry, western-blot,ELISA, real-time fluorescence quantitative PCR, the electron microscope, MTT technology both in vitro and vivo to explore the effect of kidney-reinforcing and blood-activating method on the AA bone marrow MSCs' biological characteristics and neovascularization generation,and explicit whether it works though the activation of SDF-1/CXCR4-PI3K/Akt.By explaining AA's pathogenesis in the traditional Chinese medicine in the molecular level,we aim to provide the theoretical foundation of AA kidney-reinforcing and blood-activating method in the treatment to expand its clinical therapeutic methods.

再障的中医本质是肾虚，从肾论治已经成为多数医家共识，且补肾法明显提高了临床疗效，但仍有不少患者迁延难治，值得进一步研究。我们的前期研究提示：再障较普遍存在肾虚血瘀病理基础，与现代医学再障微环境发病机制具有一定的相关性；再障MSCs数量和功能有明显缺陷；补肾活血法能有效促进再障骨髓MSCs功能恢复，能促进骨髓微环境的改善，可能是与其激活PI3K/Akt信号通路有关。本项目将采用免疫组化、western-blot、ELISA、实时荧光定量PCR、电镜、MTT等技术，分别从体内及体外研究探讨补肾活血法对再障骨髓MSCs的生物学特征和对新生血管形成的影响，明确补肾活血是否通过与SDF-1/CXCR4-PI3K/Akt信号通路起作用。从分子水平阐明再障肾虚血瘀的中医病理基础，为临床应用补肾活血法治疗再障提供依，为开拓临床治法提供理论基础。

骨髓造血微环境（HM）功能缺陷是再生障碍性贫血（再障，AA）的三大发病机制之一，从骨髓HM角度探讨补肾活血法对再障的作用机制是我们研究的主要目的。按原计划完成相关研究内容，相关论文正在整理过程中。在体外实验方面：对再障患者MSCs 分离培养、鉴定及转染；补肾活血动物血清制备，并确定最佳作用浓度；将不同的药物、拮抗剂作用与AA患者MSCs；应用CCK-8法测定MSCs 增殖率，ELISA 法进行血管生成相关调控分子表达水平测定，实时荧光定量PCR法测定VEGF、bFGF和TNF-α mRNA表达水平。结果表明：10%的低浓度组制备的含补肾活血药物动物血清为最佳浓度；从表面抗原的检测和定向诱导MSC 向成骨细胞分化角度证实了我们制备AA患者MSCs的质量稳定；证实CM-DIL可以进行标记AA患者MSCs进行示踪实验；确定了各信号通路拮抗剂对AA患者MSCs增值活性影响最佳浓度和时间；证实补肾活血中药对骨髓MSCs增值活性有明显的促进作用，其机制可能是通过提高其VEGF、PECAM-1和VCAM - 1表达有关，也与提高VEGF、bFGF和TNF-αmRNA表达水平正相关，并提示补肾活血法可能是通过CXCR4、PI3K和Akt信号通路起作用。在体内实验方面：建立免疫介导型AA小鼠模型，随机分组；运用免疫组化法检测骨髓微血管密度，ELISA 法测定各组小鼠外周血清中VEGF、SDF-1、TNF-α、TNF-、IFN-γ表达水平，免疫荧光染色检测骨髓细胞表面CXCR4 表达水平，ELISA 法检测骨髓单个核细胞PI3K-Akt 活性，实时荧光定量PCR 法测定VEGF、PECAM-1、SDF-1、CXCR4、PI3K、Akt 的mRNA 表达，采用Western blot 法测定VEGF、PECAM-1、SDF-1、CXCR4、PI3K 和Akt 的蛋白表达。结果表明：补肾活血中药可以明显提高急性再障小鼠血常规，其机制可能通过提高AA小鼠VEGF、PI3K和AKt的活性，降低SDF-1a、TNF-α、TGF-β1和IFN-γ活性有关，其作用受到CXCR4、PI3K和Akt 抑制剂的影响，提示补肾活血法可能是通过CXCR4、PI3K和Akt信号通路起作用。该项目研究部分阐明了补肾活血法治疗AA的作用机制，为通过改善骨髓微环境治疗AA提供了干预手段和实验数据的参考。

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