铜绿假单胞菌T6SS效应蛋白Tle4及其免疫抑制蛋白Tli4结构与功能研究

Gram-negative bacteria can secret diverse lipase effectors (Tle) to adjacent cell by Type VI Secretion System (T6SS), degrading the membrane components. Meanwhile,T6SS+ bacteria express cognate immunity proteins (Tli) in their periplasm to prevent self-intoxication, thereby gaining an edge in the fierce niche competition. There are five types of lipase effectors 1-5 (Tle1-5) identified in proteobacteria and these Tle proteins show little primary sequence identities except the conserved catalytic residues, suggesting that they may have uncharacterized properties in the lipase superfamily..In light of the specificity and functional significance of Tle effectors, our project is aimed to solve the structures of Tle4 and Tle4-Tli4 complex via X-ray crystallography method and elucidate the catalytic mechanism of Tle4 and the inhibitory mechanism of Tli4 to Tle4. Collectively , using biochemical and biophysical tools, we hope to find a new way to understand molecular mechanism of pathogenic Pseudomonas aeruginosa and finally, provide a basis for antibacterial drug design for eliminating the infection of these bacteria.

革兰氏阴性菌，可以通过其六型分泌系统（T6SS）分泌脂酶类（Tle）效应蛋白，破坏与之毗邻的异种细胞的细胞膜磷脂双分子层而裂菌，同时，为避免Tle对自身或者同种的细胞膜的降解，细菌本身进化出一套相应的可抑制Tle脂酶活性的免疫抑制蛋白Tli，从而保障自身在微环境中的种间竞争优势。其中通过T6SS输出的脂酶，可分为5大类（Tle1-5）。除保守的催化基序，Tle1-5与目前已知的脂酶没有明显的一级序列同源性，提示我们，此类蛋白可能蕴藏着脂酶大家族中尚且未知的特性。鉴于Tle序列特异性及功能重要性，本项目拟借助X射线晶体学手段，对铜绿假单胞菌Tle4及 Tle4-Tli4复合物进行三维结构解析，通过结构比对，定点突变及生化分析等试验，分析Tle4作为新型脂酶的催化特性，并阐明Tli4 抑制Tle4脂酶活性的分子机理，期望可为控制和预防铜绿假单胞菌感染，提供新的靶向治疗视角。

VI型分泌系统(T6SS)是近年来在革兰氏阴性菌中鉴定出的可区分自我与异己，从而参与调控种间竞争的分泌大机器。它通过注射多种效应蛋白到与其临近的异种细胞中，导致异种受体细胞死亡或生长停滞，同时在同种细胞中，为免受这些效应分子的毒害，T6SS+细菌同时表达与各种效应分子对应的同宗免疫蛋白，从而使毒素效应蛋白在同种细胞中失活。Tle4-Tli4 (PA1510-PA1509)是在铜绿假单胞菌中鉴定出来的由H2-T6SS调控的毒素-免疫蛋白对。Tle4具有磷脂酶活性，可以降解竞争细胞的细胞膜，而在自身细胞的周质空间则有Tli4。我们的研究，解析了Tle4-Tli4复合物的结构，分辨率为1.75 Å。此复合物结构中，Tle4包括两个domain：一个保守的α/β-水解酶domain和一个不常见的由两个盖子domain(lid1 and lid2)形成的可把催化残基埋进去的漏斗样结构的cap domain。Tli4也包含两个结构域，形成一个蟹爪样结构。Tli4通过这个蟹爪样的结构，抑制Tle4的cap domain，从而阻断Tle4膜接触激活的水解酶活性。本研究丰富了我们对 T6SS 效应蛋白的认识，并为控制病原菌感染提供了必要的结构基础。

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