周期性机械应力下髓核细胞integrinα1-Git1-PLCγ1 信号传导机制的研究

Periodic mechanical stress could significantly promote nucleus pulposus cell proliferation, migration and matrix synthesis. However, the mechanisms underlying the ability of nucleus pulposus cells to detect and respond to periodic mechanical stress have not been well delineated. Our previous study confirmed that PLCγ1 mediated mechanical stimulation-initiated nucleus pulposus cell proliferation, migration and matrix synthesis. However, the upstream signaling proteins of PLCγ1 have yet to be explored. Based on our previous study, we demonstrate a hypothesis that periodic mechanical stress could promote nucleus pulposus cell proliferation, migration and matrix synthesis through integrin α1→Git1→PLCγ1 signaling pathway. In order to verify the above hypothesis, we adopt the selective inhibitors, shRNA and point mutation techniques to inhibit the activation of the above signaling proteins, and we use Western bloting, Real-time PCR and scratches healing experiment to determine the role of the signaling proteins in periodic mechanical stress-upregulated nucleus pulposus cell proliferation, migration and matrix synthesis, including the nature of any functional association among the signaling proteins. This study was designed to determine the mechanism of signal transduction by which periodic mechanical stress promotes nucleus pulposus cell proliferation, migration and matrix synthesis. This study will lay the foundation for further investigations regarding nucleus pulposus cell mechanobiology under periodic mechanical stress and how to improve the quality of tissue-engineered nucleus pulposus.

周期性机械应力能促进髓核细胞增殖、迁移和细胞外基质合成，但其机制尚不明了。我们的前期研究证实，PLCγ1在周期性机械应力引起髓核细胞增殖、迁移和细胞外基质合成中发挥了重要作用，但是调控PLCγ1的上游信号蛋白尚不清楚。在前期研究的基础上，我们提出了如下假说，周期性机械应力通过integrin α1→Git1→PLCγ1信号通路促进髓核细胞增殖、迁移和细胞外基质合成。为了验证上述假说，我们拟采用相应的抑制剂、shRNA干扰和点突变技术阻断相应信号蛋白的活化，通过Western bloting、Real-time PCR和划痕愈合实验等检测方法，以确定相应信号蛋白在周期性机械应力促进髓核细胞增殖、迁移和细胞外基质合成中的作用，以及相应信号蛋白之间的上下游关系。本研究旨在探讨周期性应力促进髓核细胞增殖、迁移和细胞外基质合成的信号传导通路，为进一步深入探讨如何提高组织工程椎间盘髓核的质量奠定基础。

腰椎间盘髓核退变和突出是临床常见疾患，其临床治疗一直是个难题。组织工程腰椎间盘髓核是治疗和修复脊柱退变性疾病最有希望的方法之一。研究者们发现周期性机械应力是影响髓核细胞结构和基质合成中重要的调节因素，因而在构建优质的组织工程椎间盘髓核过程中得到应用。本小组的研究证明了一定压力和频率（0～200kpa，0.1Hz）的周期性机械应力可以显著促进髓核细胞的增殖、迁移和细胞外基质的表达，从而提高种子细胞的功能。然而当前国内外对于周期性机械应力促进髓核细胞增殖和细胞外基质合成的机理研究甚少。在前期研究的基础上，我们提出了如下假说，周期性机械应力通过integrin α1→Git1→PLCγ1信号通路促进髓核细胞增殖、迁移和细胞外基质合成。为了验证上述假说，我们采用相应的抑制剂、shRNA干扰和点突变技术阻断相应信号蛋白的活化，通过Western bloting、Real-time PCR和划痕愈合实验等检测方法，以确定相应信号蛋白在周期性机械应力促进髓核细胞增殖、迁移和细胞外基质合成中的作用，以及相应信号蛋白之间的上下游关系。. 本研究证实了1、在周期性机械应力下髓核细胞integrin α1基因表达水平明显升高,同时Ⅱ型胶原和蛋白多糖的基因表达明显增加。而当integrin α1干扰后，髓核细胞的增殖也同样受阻，说明integrin α1在周期性机械应力对髓核细胞的代谢过程中，具有促进作用，在压力信号传导中起到关键作用； 2、Git1蛋白在髓核细胞压力-信号传导途径中起着重要的调控作用,同时当integrin α1干扰后，Git1蛋白的磷酸化也受到显著地抑制，说明Git1蛋白接受来自integrin α1的压力信号；3、PLCγ1蛋白在大鼠髓核细胞压力-信号传导途径中起着同样重要的信号传递作用，当integrin α1干扰后，PLCγ1蛋白的磷酸化及Ⅱ型胶原和蛋白多糖受到明显地抑制，说明PLCγ1蛋白接受来自integrin α1的压力信号并向下游传递；4、Git1基因干扰后，部分抑制了PLCγ1蛋白的磷酸化水平，说明Git1对PLCγ1有部分调控的作用。. 本研究旨在探讨周期性应力促进髓核细胞增殖、迁移和细胞外基质合成的信号传导通路，为进一步深入探讨如何提高组织工程椎间盘髓核的质量奠定基础。

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