新型AMPK激动剂通过抑制“脂代谢紊乱—活性氧簇—炎症”途径改善非酒精性脂肪肝炎

The applicant laboratory identified a novel AMPK agonist-117，which improved lipid toxic liver injury, inhibited the release of inflammatory factors and eliminated free radicals，under the previous funding of National Natural Science Foundation. Based on preliminary experiments, the applicant raised a hypothesis: 117 inhibits "Lipid metabolism disorder - Reactive oxygen species (ROS) - Inflammation" pathway through activation of AMPK, and suppress the process of NASH deterioration. There are three overlap issues to be investigated in this project: 1. Use whole tissue metabolomics and expression genomics to obtain holographic dynamic association between animal models of hepatic lipid metabolism improvement and oxidative stress-inflammatory response inhibition in 117 treatment on in vivo NASH model; 2. In the primary cultured cell model, explore the mechanisms of 117 activated AMPK effect on restore the lipid metabolism homeostasis, eliminate ROS and inhibit inflammatory signaling pathways by using transmission electron microscopy, co-immunoprecipitation, isotope tracing and molecular biology method; 3. Verify above hypothesis from both positive and negative evidence in AMPK over-expression and siRNA interference cells. Present study for the first time confirms the feasibility of AMPK on lipotoxicity liver injury treatment and provides the theoretical basis and new insight for NASH prevention and therapy.

经国家自然基金前期资助，申请者团队证实：新型AMPK 激动剂（代号117），可显著改善非酒精性脂肪肝炎（NASH）的脂毒性肝损伤，抑制炎症因子释放并清除体外模型的自由基生成。据此申请者提出假说：新型AMPK激动剂可能通过抑制"脂代谢紊乱-活性氧簇（ROS）-炎症"途径，遏制NASH 的炎症恶化。 研究思路：①应用代谢组学和转录组学方法，在体内NASH模型上，获得117抑制氧化应激的生物标志物和降低炎症反应的转录信号证据；②在原代细胞模型上，利用透射电镜、免疫共沉淀、同位素示踪和分子生物学等手段，阐释117激活AMPK后，通过介导ROS 清除、抑制炎症因子表达，改善NASH的分子机制；③采用AMPK超表达和siRNA 干扰技术，从正反两方面验证上述假说。 本项目旨在阐明新型AMPK激动剂117改善NASH的分子机制，为NASH治疗药物的研发提供新实验依据。

非酒精性脂肪肝（NAFLD）不但造成体内能量代谢紊乱，并且也是心血管病变的风险因素。本课题以AMPK相关靶标作为切入点，对AMPK激动剂对非酒精性脂肪肝及炎症的改善作用进行探讨。.1..在金黄地鼠和ob/ob小鼠模型上，新型AMPK激动剂IMM-H007显著改善的高脂饲料诱导非酒精性脂肪肝。200mg/kg剂量给药，动物血脂水平降低，病理结果显示肝脏脂肪变性程度显著降低，脂肪MRS特征谱和游离脂肪酸的快速定量结果提示肝脏饱和脂肪酸水平显著下降。基于NMR技术的代谢组学研究结果表明，H007改善肝脏内源性代谢物的代谢模式，使其向正常回归。.2..非酒精性脂肪肝的发展伴随着氧化应激损伤和炎症的发生，长期高脂饲料喂养，动物肝脏损伤指标血清转氨酶水平显著上升，肝脏组织内MDA升高，而LDH和SOD等指标显著下降，结果提示肝脏氧化应激压力增加；基因表达谱结果显示肝脏中细胞生长、免疫、细胞分化，脂质代谢相关基因表达发生了明显变化；而给予H007或其代谢产物后，肝脏氧化应激水平和炎症相关基因表达均出现下降。.3..H007可以激活肝脏内AMPK磷酸化活性，调节脂质代谢紊乱，影响炎症因子表达。H007可以显著提高体内外肝脏细胞内的AMPK磷酸化水平，并调控下游ACC，SREBP等分子的活性，增加脂肪酸氧化，抑制脂肪合成。H007抑制脂肪炎症刺激后肝细胞内NF-κB P65的表达，降低MCP-1等炎症因子表达。AMPK抑制剂可以取消H007上述作用，确认H007是通过AMPK发挥脂代谢调控和抑制炎症信号的作用。.4..H007抑制肝脏募集炎症细胞，改善肝脏微循环损伤。采用地鼠活体荧光标记观察肝脏微循环的炎症细胞粘附，结果显示H007可以显著减少白细胞在脂肪肝血管内壁的滚动、粘附数量；免疫组织化学结果显示，H007可以降低肝脏内F4/80巨噬细胞标记数量。.上述结果显示，H007能够通过激活脂肪肝内AMPK活性，调控脂肪代谢途径，降低肝脏氧化应激水平，并抑制炎症因子表达，从而降低肝脏炎症细胞募集，达到抑制脂肪肝的炎症发生。本课题初步探讨了H007改善由高脂膳食诱导非酒精性脂肪肝的炎症发生的机制，为H007治疗脂代谢相关疾病的临床应用提供了实验依据。

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