专一性同时脱硫脱氮菌株的构建及其在原油生物处理中的应用

化石燃料中的含硫含氮杂环类化合物在燃油燃烧过程中释放出大量的氧化物，是环境的主要污染源。生物脱硫脱氮由于条件比较温和对环境无二次污染而逐步受到重视。然而，与生物脱硫相比，现有的脱氮菌株由于没有专一代谢途径，生物处理会损失燃烧值而限制了生物脱氮的应用。另一方面，生物脱硫脱氮是由不同的菌株来完成，为了降低成本，有必要寻找或构建能够同时专一性脱硫脱氮的菌株。针对现有生物处理存在的不足，本申请拟通过途径工程改造，进化新型脱氨酶，与咔唑降解第一步反应的相关基因组装，人工设计新型的咔唑专一性代谢途径，并将其导入脱硫菌株中，构建可以同时专一性脱硫脱氮的工程菌株；进而采用进化代谢工程手段优化菌株，提高工程菌株的催化能力。阐明重组菌株代谢模式化合物有机硫二苯并噻吩和有机氮咔唑的机制；进行原油同时脱硫脱氮试验，分析处理前后原油里面硫、氮杂环类化合物的变化情况，为大规模使用生物催化剂处理原油打下理论基础。

化石燃料中的含硫含氮杂环类化合物在燃油燃烧过程中释放出大量的氧化物，是环境的主要污染源。生物脱硫脱氮由于条件比较温和对环境无二次污染而逐步受到重视。与生物脱硫相比，现有的脱氮菌株由于没有专一代谢途径，生物处理会损失燃烧值而限制了生物脱氮的应用。另一方面，生物脱硫脱氮是由不同的菌株来完成，为了降低成本，有必要寻找或构建能够同时专一性脱硫脱氮的菌株。针对现有生物处理存在的不足，本申请拟通过途径工程改造，进化新型脱氨酶，与咔唑降解第一步反应的相关基因组装，人工设计新型的咔唑专一性代谢途径，并将其导入脱硫菌株中，构建可以同时专一性脱硫脱氮的工程菌株。在项目执行期间，进行了多个苯环脱氨酶资源的挖掘和资源筛选工作，先后克隆了来自苯胺降解菌Pseudomonas sp. AP-3的脱氨酶AmnE、Comamonas sp. CNB-1的脱氨酶基因cnbZ、Rhodopseudomonas palustris HaA2的脱氨酶基因和Bradyrhizobium sp. JS329菌的负责降解5-硝基邻氨基苯甲酸到5-硝基水杨酸的NaaA基因，完成了以上基因的异源表达和酶活力表征。完成了Pseudomonas sp. AP-3脱氨酶AmnE的晶体结构解析，从结构上指导了酶分子的改造，增强了该酶对2-氨基联苯的降解能力。NaaA基因是目前报道的唯一可以脱除苯环上氨基的脱氨酶（但该酶底物特异性很强），本研究尝试对该酶进行了分子进化，将NaaA基因与咔唑降解的第一步咔唑1,9a-双加氧酶进行串联表达，发现NaaA基因的导入可以加快咔唑的降解，初步证明突变的基因对咔唑降解的第一步产物有活力。在研究过程中，我们也对咔唑降解的第一步基因进行了简化，删除了中间的位置功能基因orf7基因。本研究也是首次证实orf7基因至少对第一步的咔唑降解不是必需的。由于NaaA蛋白仅报道可以催化氮元素的脱除，而咔唑1,9a-双加氧酶仅能降解咔唑，并且不造成碳原子的损失，因此串联表达的基因簇可以降解咔唑但不造成碳原子的损失，在生物处理原油中有优势。将串联表达的基因导入了脱硫菌株中，成功构建了可以同时降解咔唑和二苯并噻吩的工程菌株。进一步完成了脱硫菌株的全基因组测序和注释工作，为继续改造菌株，提高脱硫脱氮效率提供了改造的靶点。完成了华北油田井下微生物群落变化情况研究；为正在开展的石油脱硫脱氮奠定了微生物基础。

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