泥河湾古遗址原核微生物的分子勘探及放线菌物种分离和系统分类

Nihewan sites located in Yangyuan County of Hebei Province, which were recognized by the International Geological archaeological community due to the Quaternary standard strata, abundant mammalian fossils and human paleolithic relics. The Nihewan Basin is a very important area to explore the origin of human beings. The age of the Black Trench sites is 177-195 million years. The "Oriental Human Origins Project", carried out by the Chinese Academy of Social Sciences, the Hebei Provincial Cultural Relics Bureau and other units in 2013, comprehensively promoted the archaeological excavations for the Nihewan sites. But in the above "project" and even in the last century's research, the work was focused on the field of paleontology, ancient culture, environment and geology, and never involved in the ancient microbial content. Thus, the blank in the ancient microbial research field of the Nihewan site groups is regretful. The aim of this study is to reveal the ancient prokaryotic microbial species diversity overview of the Nihewan sites by 454 high throughput sequencing of 16S rDNA sequences. The method of species isolation and culture-independent method will be simultaneously used to investigate the ancient actinomycetes species diversity. The research findings of this project will not only fill the blank of the previous studies, but also provide valuable scientific information for the study of the major scientific issues of geology, environmental science, prevalence of pathogenic microorganisms and enhance the international status of China's ancient prokaryotic research areas.

泥河湾遗址群分布在河北省阳原县，因具有国际地质考古界公认的第四纪标准地层、丰富的哺乳动物化石和人类旧石器遗迹而闻名于世，是探索人类起源的一个重要地区，其中黑土沟遗址距今已177-195万年。2013年中国社会科学院与河北省文物局等单位联合开展的"东方人类探源工程"，全面推进了泥河湾遗址群考古调查发掘工作。该工程及以往近百年来的国内外学者的研究集中于古生物、古文化、环境及地质学等领域，从未涉及古微生物的研究内容，这也是泥河湾遗址群科学研究中的一个遗憾。本项目通过对宏基因组中16S rDNA序列的454高通量测序，揭示泥河湾遗址不同地质时期远古原核微生物物种多样性的概貌；采用分离法和免培养法，揭示远古放线菌物种多样性和系统分类地位。本项目研究成果不仅填补以往研究的空白，也为地质学、环境科学、病原微生物流行等重大科学问题的研究提供保贵的科学资料，提升我国古原核生物系统学研究领域在国际上的地位。

本研究以河北省阳原县东谷坨村的黑土沟遗址为主要研究区域，以10个不同地质年代的地质层为研究对象，采用不同的分离方法分离不同地质样本的远古放线菌，分离到1088株放线菌纯培养物并冻干保藏，创建了泥河湾特殊环境的放线菌资源库，根据16SrDNA全序列测序及系统发育分析，其分别归属于放线菌门(Actinobaceteria)，放线菌纲(Actinobaceteria)，放线菌亚纲(Actinobacteridae)，放线菌目(Actinomycetales)的8个亚目10个科的16个属和2个潜在的新属，4个潜在的新种。. 采用宏基因组克隆技术，获得938条放线菌16S rDNA全长序列，并构建泥河湾放线菌16S rDNA全长序列克隆文库，文库保藏与河北省生物工程实验室，建立泥河湾古遗址放线菌属以上等级的物种多样性数据库；. 采用高通量测序技术自泥河湾土壤中获得301749条优质真核微生物ITS序列和596673条16S rDNA V4可变区优质序列，揭示出泥河湾在百万年间原核微生物和真核微生物群落结构的变化和远古时代泥河湾古遗址原核和真核微生物物种多样性的概貌，建立了原核微生物和真核微生物的分子勘探档案库；. 采用宏基因组测序技术初步分析了泥河湾不同地质年代微生物的群落的发展、进化。初步认为，泥河湾土壤样本与环境相关的序列丰度在一百万年前在小幅波动，而一百万年前至今则发生了较大的变化，预示着这段时期泥河湾生物生存环境发生了较大改变，或许是导致古人类发生迁移的一个因素。另一数据表明，在距今110-130万年前，与人类疾病相关的基因序列达到了一个峰值，疾病或许是使泥河湾古人类数量减少或被迫迁移的一个因素。同时，生物类群数量及进化树的拓扑结构在百万年前变化幅度较小，而在距今110-130万年前左右生物类群数量发生显著降低，进化树拓扑结构发生了较大改变，在距今几十万年前的土壤样本则生物类群数量及进化树的拓扑结构又恢复，而当代土壤又发生了较大变大。. 采用 Biolog生态板技术，分析泥河湾土壤样本微生物群落对31种有机碳源的利用情况，通过主成分分析，揭示不同样本土壤中微生物群落代谢类型存在差异性。

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