O157多糖蛋白疫苗的糖链数目及长度最佳配比研究

多糖蛋白缀合疫苗占目前多糖疫苗的多数。目前多糖蛋白缀合疫苗生产多采用化学缀合方法，这一方法很难控制糖链和蛋白的结合，因此难以实现糖链结合数目及糖链长度最佳配比。本申请的目标在于试图通过生物法来实现这一目的。主要是以大肠杆菌O157:H7为例，利用细菌蛋白糖基化系统和细菌脂多糖（LPS）合成途径，通过对蛋白糖基化改造和宿主菌LPS 合成途径相关酶的研究及改造，构建重组菌，在重组菌体内合成多种糖链数目和长度不同配比的多糖蛋白缀合物，为生产免疫效果最佳的多糖蛋白缀合物疫苗奠定基础。本项目选用大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)成为作为新的载体蛋白。经过基因分析，我们发现理论上突变的糖基化位点是133,178,303，341 位。结合晶体结构和其他的数据，我们对每个糖基化位点突变5 个氨基酸，共突变20 个氨基酸。同时在大肠杆菌麦芽糖结合蛋白MBP C-末端插入4个连续的DQNAT。突变后的MBP被构建到结合有PglB的质粒上。构建好的载体转入BL21中进行表达。WESTERN 检测发现，和未改造MBP的相比，基因改造的MBP成功的被糖基化。一些研究初步表明，Wzz 可能会参与多糖糖链长度的控制。我们选用不同类型不同来源的Wzz，通过表达不同来源的Wzz，实现LPS的长度调节。大肠杆菌W3110被作为模式宿主。本实项目成功将E.coli W3110和O157:H7 中脂多糖(LPS)合成相关基因waaL敲除，并进行了验证。同时将大肠杆菌O157:H7的O－抗原合成基因簇转入宿主菌，实现模式宿主菌中特异O多糖的合成。把糖基化改造后的MBP和pglB分别重组到质粒上，转化到改造过的宿主菌中，构建好PglB的多糖-蛋白缀合疫苗平台, 对获得的糖-蛋白缀合物进行检测。免疫后动物的抗体滴度检测检测多糖蛋白缀合物疫苗的生物效果。结果MBP-PS能够激起小鼠产生较高的抗O157的IgG抗体。同时对不同多糖缀合疫苗性质分析和生物活性检测，确定不同载体蛋白及其不同位置多肽对糖缀合物疫苗抗多糖IgG 滴度和亚型的影响。