HIF1与LHBs的相互作用及其在乙型肝炎发生发展中的作用研究

Hepatitis B virus large surface protein (LHBs) is a complete S protein transcribed and translated by S gene, which has many cellular functions, and is an important factor in the process of chronic HBV infection. In our previous work, hypoxia induced factor 1 (HIF1) was identified to be interacted with LHBs. And the level of HBV DNA decreased significantly after down-regulating the expression of HIF1 in HepG2.2.15. However, what is the relationship between HIF1 and LHBs and how does it affect the development of chronic hepatitis B? In current case, the interaction between HIF1 and LHBs will be further confirmed by immunoprecipitation and GST pull-down assays in vivo and in vitro. In addition, we will perform a systematic proteomic analysis of HIF1-associated proteins in HepG2.2.15 cells to gain a better insight into the molecular mechanism of HIF1 in chronic HBV infection. A new developed technique called QUICK (quantitative immunoprecipitation combined with knockdown), which integrated immunoprecipitation, RNAi, iTRAQ and quantitative Mass technologies, will help a lot in the whole process. After using this system coupled with bioinformatics, a protein interaction map of HIF1 will be generated, and the molecular regulatory mechanism from LHBs to HIF1 will be revealed. These data would be valuable for further study of the mechanism of chronic HBV infection, and also provide some new clues for curing chronic HBV infection.

乙型肝炎大表面抗原LHBs是病毒S基因编码的完整蛋白，与病毒组装、释放等过程密切相关；近年来发现其与另一个病毒编码蛋白HBx一样，也是在乙型肝炎发生、发展过程中起重要作用的转录激活蛋白。申请者一直致力于LHBs相关功能的研究。我们在前期工作中首次发现LHBs与缺氧诱导因子HIF1存在相互作用；并且在HBV复制细胞系中敲除HIF1，能显著影响病毒复制水平。那么，两者的相互作用对HBV复制及乙型肝炎的发生、发展有何作用？这些作用具体又是如何实现的？本项目拟采用定量免疫共沉淀结合小干扰RNA技术研究蛋白质相互作用谱（“QUICK”）的方法，在HBV复制细胞系中分离、鉴定出与HIF1存在相互作用的蛋白分子；并通过生物信息学方法，绘制出HIF1在慢性HBV感染中的相互作用分子网络，以探讨LHBs调控HIF1表达的机制、HIF1参与HBV复制及乙型肝炎发生发展过程的确切机制。

病毒性肝炎是严重危害人类健康的重大疾病。它传染性强、传播途径复杂、发病率高、危害严重。目前已分离出的五型肝炎病毒(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型) 中，乙型和丙型危害最大，它们是引起肝脏慢性炎症，甚至肝硬化、肝功能衰竭、肝细胞肝癌等终末期肝病的重要病因。近年来，HCV的治疗取得了突破性进展。直接抗病毒药物可使90%以上的HCV感染者在治疗后获得持续的病毒学应答。但是对于慢性HBV感染而言，目前的整体治疗效果尚不能与HCV感染相媲美。因此，深入探究HBV的复制周期及其调控机制，以及乙型肝炎发生、发展的分子机制，为寻找新的抗病毒治疗靶点提供理论依据，具有极其重要的意义。. 课题组在前期研究中首次发现：缺氧诱导因子-1在HBV复制细胞系中高表达（Oncotarget. 2017 Jan 17;8(3):4549-4562.）；且敲除HIF1，能显著影响病毒复制水平，从而证明HIF1与HBV的复制密切相关。在国家自然科学基金的资助下，我们采用一系列分子生物学技术，进一步证实了HIF1与LHBs在物理和功能上的相互作用；应用转染、RNA小干扰、免疫共沉淀、稳定同位素标记及质谱分析技术，在HBV复制细胞系中分离鉴定出与HIF1相互作用的蛋白分子，并通过生物信息学方法，描绘出HIF1在慢性乙型病毒性肝炎中的相互作用网络。今年我们按照实验计划，对与HIF1相互作用的候选蛋白，从其对HBV病毒复制、以及肝细胞增殖转化的影响等方面进行了功能验证。. 上述研究成果的取得，有助于我们了解 HBV慢性感染过程中，病毒复制与宿主基因调控之间的交互作用，丰富我们对HIF1参与功能基因表达调节机制的认识，同时还将研究HIF1在HBV复制及乙型肝炎发生发展中的具体机制；将为阐明HBV复制调控的新机制，寻找新的抗病毒药物治疗靶点提供理论依据。

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