烟草N’直系同源基因抗TMV-U1株系关键区域和motif的定位

Despite a mass of resistant genes (R gene) have been cloned, the mechanism, e.g. pathogen and strain recognition specificity determination, underlies most of them remains obscure. To achieve the ultimate goal of rational designing R gene with novel recognition activity to encounter disease, the critical sites of R gene should be further investigated. The study of function alterations of R gene after the critical sites mutation could help reveal the resistance mechanism. Our group has recently discovered that N’ orthologs are widely harbored in wild Nicotiana species and share a high identity. The N’ orthologs have resistance differentiation against TMV-U1 due to critical motif and amino acid mutation as predicted, providing an ideal model to study the mechanism of NBS-LRR R gene recognition specificity. By employing pseudo-recombination between N’ orthologs resistant and sensitive to TMV-U1 and Site-directed mutagenesis, this project will attempt to locate the critical fragments, motifs and amino acids leading to resistance differentiation. The anticipated results will provide important new insights of the pathogen recognition and evolution mechanism underlying the NBS-LRR gene mediated resistance against different virus strains, and thus guide the precise breeding with gene editing technology to confer broad-spectrum TMV resistance on major tobacco varieties.

尽管已经有众多抗病基因（R基因）被克隆，但是大部分R基因的抗性机理（例如病原特异性和株系特异性）依然没有明确。为了最终能够“理性设计（rational design）”出特定抗性的R基因，就需要对抗性基因的核心位点进行深入的研究。通过对R基因关键位点突变前后的功能差异进行分析，能够揭示其作用机理。申请人研究组最近在对多个烟草野生种中存在的N’直系同源基因研究后发现，这些同源基因序列相似性高但却对TMV不同株系存在明显的抗性分化，预测为重要的氨基酸或者motif的突变所导致，这为研究NBS-LRR类抗病基因的特异性识别机制提供了理想的模型。本项目将通过不同抗病谱的N’直系同源基因之间的假重组实验并结合定点突变分析，精确定位导致抗性分化的核心区域和motif。项目结果将有助于揭示NBS-LRR类抗病基因的特异性识别和进化机制，也为基因编辑改良烟草主栽品种扩大TMV抗性谱提供指导。

TMV是烟草的重要病害，目前抗TMV育种仅使用N基因，烟草育种中使用的N基因片段具有连锁累赘，会导致烟草产量较低、上部叶落黄较慢等不良性，因此携带N基因的抗TMV烤烟品种难以推广。同时长期使用单一抗源存在抗性被病毒克服的风险。因此开发利用新的抗性基因，对植物抗TMV育种意义重大。本项目针对这一问题，获得了以下研究结果：.1）克隆并鉴定了几个来自野生烟的N’同源基因在烟草中的抗性，证明N’alata、N’goodspeedii和N’gossei具有作为抗病基因应用于抗性育种的价值。.2）栽培烟草中本身携带的N’基因不具有针对TMV-U1株系的抗性，而N’alata等来自野生烟的N’同源基因具有针对TMV-U1的抗性。通过N’和N’alata之间的基因重组，项目组定位了N’alata中与抗性相关的核心区域，即N’alata的第265-798 个氨基酸以及第1130-1233个氨基酸区域共同决定了其对TMV-U1的抗性，在此基础上进一步定位到7个决定该抗性的氨基酸位点，为进一步揭示该抗性基因的原理及利用该抗性基因奠定了基础。.3）为改造栽培烟草中N’基因，项目组通过建立原生质体基因编辑及再生植株的体系，于国际上首次实现了烟草中大片段基因无缝替换和插入。利用该技术体系，项目组利用N’alata基因中的两个抗性核心区域（长1819 bp和380 bp）分别替换了栽培烟草K326中N’基因的对应区域，获得的植物材料获得了针对TMV的抗性。该研究以原生质体转染和植株再生为基础，克服了目前烟草基因编辑只能敲除基因的缺点，首次实现了烟草中长基因片段的无缝插入和替换。本研究建立的技术体系，可以通过改造植物基因的编码区直接获得目标性状，拓展了基因编辑技术在植物中的应用范围。.4）确定了烟草花叶病毒（TMV）运动蛋白（MP）中两个新的与胞间连丝定位相关的结构域，分别为TMV MP 的 61 至 80 位和 147 至 170 位氨基酸残基。证明了TMV MP61-80的片段与 SYTA 相互作用，为进一步揭示TMV MP定位到胞间连丝的机理奠定了基础。

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