核糖核酸蛋白介导的CRISPR/Cas9精准治疗Pmca2基因突变耳聋小鼠的研究

Genetic hearing loss affects one in thousand newborns without available biological treatment. Previous study proved that CRISPR/Cas9 mediated gene editing can restore hearing of dominant genetic deafness mice, but whether gene editing could rescue other types of genetic deafness or adult mice is unclear. Pmca2 point mutant which causes progressive hearing loss and hair cell death in mice, showing aploinsufficiency deafness, is an ideal mouse model for gene therapy by CRISPR/Cas9. The purpose of this project is to modify mutation gene in newborn (Scala media micro-injection) and adult (Posterior semicircular canal injection) mouse, measuring hearing by Auditory Brainstem Response and Distortion Product Otoacoustic Emission, auditory behavior test, testing function in cell level by immunohistochemistry, electrophysiology and two-photon microscope, detecting gene editing efficiency and off-targets by next generation sequencing. We attempt to testify the possibility of gene therapy in neonatal and adult haploinsufficiency genetic deafness mice by CRISPR/Cas9, providing evidence for clinical trial of gene therapy on genetic deafness.

新生儿中遗传性耳聋发病率高达千分之一，但尚无有效病因治疗。前期研究证实CRISPR/Cas9基因编辑可以治疗新生小鼠显性遗传性耳聋，CRISPR/Cas9精准治疗其他类型的遗传性耳聋及成年小鼠仍是空白。小鼠Pmca2基因点突变导致听力渐进性丧失和毛细胞进行性凋亡，具有单倍体显性不足表征，是利用CRISPR/Cas9治疗的良好模型。本研究利用CRISPR/Cas9对Pmca2突变新生小鼠（耳蜗微注射）和成年小鼠（后半规管注射）致聋基因进行修改，通过听性脑干诱发电位（ABR）／畸变产物耳声发射（DPOAE）检测听力，行为学评估听觉，免疫组化、电生理、双光子检测细胞功能，高通量测序检测基因编辑效率和脱靶率，以期证实CRISPR／Cas9基因编辑能够安全有效治疗新生和成年单倍体显性不足遗传性耳聋小鼠模型，并建立耳聋基因编辑方法学，为遗传性耳聋精准基因治疗临床转化提供依据。

耳聋是重大公共卫生问题，我国现有听力言语残疾者2780万，其中三分之二的耳聋是遗传因素导致，然而对于遗传性耳聋患者的病因治疗尚无任何进展。申请人发现核糖核酸蛋白(RNP)可以转运CRISPR/Cas9至小鼠耳蜗毛细胞，有效对毛细胞进行基因编辑，并能部分恢复Tmc1基因突变导致的遗传性耳聋小鼠听力损失。然而前期研究局限于单基因所致的显性遗传性耳聋小鼠，基因编辑工具能否治疗遗传性耳聋患者还有很多问题需要解决。PMCA2是细胞膜上一种转运蛋白，主要作用是将细胞内钙转移到细胞外，是细胞保持胞内稳态重要的通道蛋白，在内耳主要分布于外毛细胞。Pmca2(2630 C>T)突变杂合突变鼠在一月龄即开始出现高频听力下降和耳蜗底圈毛细胞凋亡，是基因治疗合适对象。. 通过构建CRISPR/Cas9体外编辑体系，根据Pmca2基因突变的位点设计Guide RNA(gRNA)，在纯合突变小鼠和野生型小鼠的原代培养成纤维细胞测试，根据T7EI结果选择效率最高的gRNA(Pmca2-mut4)。然后检测CRISPR/Cas9改善Pmca2突变小鼠耳蜗毛细胞功能，注射入出生后0-2天(P0-2)的Pmca2杂合突变及野生型小鼠右侧内耳，以对侧耳作为对照。选择术后不同时间点收集小鼠内耳，发现内耳外毛细胞数量、纤毛形态明显好转。注射入P0-2的Pmca2杂合突变及野生型小鼠右侧内耳，在小鼠一月龄、两月龄听力比对侧未治疗耳有明显的好转，但三月龄未检测到听力的恢复。. 在治疗过程中，发现RNP介导的递送效率偏低，仅20%左右，这可能是听力恢复长期效果不佳的原因。为提高基因编辑效率，采用腺相关病毒(AAV)介导的基因编辑治疗，目前已完成AAV介导的内耳基因编辑，计划进一步开展相关基因治疗研究。. 在本课题的资助下，在Hearing Research, Gene Therapy, Aging, Neural Plasticity, Neuroscience Letters等杂志发表论文5篇，其中Gene Therapy是封面报道文章；并获批2022年国家自然科学基金优秀青年项目。.

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