RKIP磷酸化交叉调控MAPK信号通路与GPCR信号通路的分子机制和结构基础

本项目采用异核多维NMR、圆二色、荧光等谱学方法揭示了RKIP交叉调控MARK通路和GPCR通路的分子机制和结构基础。首先，制备了同位素标记（15N/13C）的RKIP蛋白样品，完成了RKIP蛋白的主链和侧链共振信号的归属，化学位移数据已存入BMRB数据库（accession code 16992）。并且测定了RKIP蛋白的溶液结构，三维结构的坐标数据已存入PDB数据库（accession number 2L7W）。hRKIP 蛋白溶液结构与已报道的晶体结构极其相似，两者在二级结构区域的主链CA 原子的均方根偏差为 1.2Å。hRKIP 蛋白的主链动力学分析表明，hRKIP总体序参数的平均值为0.89，整体结构比较刚性，有着一个比较好的球形结构。处于结合口袋底部和顶部的氨基酸（T69、W84、Y120 、D175）存在微秒-毫秒时间尺度的慢交换。其次，制备了RKIP (S153E)突变体来模拟磷酸化的RKIP，热稳定性和脲稳定性结果均显示突变体RKIP(S153E) 比野生型RKIP的稳定性有所下降。2D 1H-15N HSQC实验表明，S153E 突变使得RKIP配体结合口袋和“loop127-150” 区的构象有所改变。动力学实验分析表明， S153E 突变体的内部柔性比野生型有所增加，尤其是C 端螺旋上的171~ 182 残基的变化比较大。S153E突变体构象和动力学的变化使得RKIP的配体结合特性发生了改变。荧光滴定实验表明， S153E突变体结合配体PE的能力提高了大约1倍，而且S153E突变体不仅可以结合Raf1蛋白，也可以结合Grk2蛋白，说明S153E突变体已经具备磷酸化RKIP的性质。核磁滴定实验表明， RKIP是通过改变配体结合口袋和“loop127-150”区的构象来协调与Raf1， Grk2，以及配体的相互作用。这些工作为阐明RKIP交叉调控MARK通路和GPCR通路的分子机制提供了理论基础。此外，我们以RKIP的配体结合口袋为活性中心，通过计算机模拟，筛选出四种可以与RKIP蛋白相互作用的药物分子，结合常数分别为：3.6 M, 2.32 M, 0.74 M, 5.17 M。目前正在进行这些配体对RKIP与Raf1， 以及RKIPS153E与Grk2相互作用的干扰实验。