CPX在脑缺血再灌注损伤后兴奋性神经毒性中的作用和机制

谷氨酸是中枢神经系统中含量最高的兴奋性氨基酸，尽管缺血性脑损伤的病理生理机制至今尚未完全明确，有足够的证据证明谷氨酸介导的兴奋性神经毒性参与了这一损伤过程。近年来，与SNAREs蛋白复合体相关的神经递质释放的分子生物学机制取得了突破性进展，SNAREs（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor-attachment protein receptor）是由突触囊泡蛋白、突触膜蛋白SNAP25和突触融合蛋白-1组成的三元复合体。现已明确，突触以钙依赖性胞裂外排方式释放神经递质依赖于三元复合体的装配过程，而这种装配过程又受其结合蛋白的影响，其中Complexins（CPX）的作用非常重要。但CPX调控的SNAREs复合体介导的神经递质释放过程是否在缺血性脑损伤中发挥作用，国内外尚未见报道。本课题采用大脑中动脉阻塞法建立局灶性脑缺血及再灌注损伤模型，并通过细胞糖氧剥夺法建立脑皮层神经元和星形胶质细胞缺血及再灌注损伤模型，体内外分别应用基因敲低和RNA干扰方法沉默SNAREs复合体调控蛋白CPXs的基因表达。通过行为学、形态学、分子生物学、高效液相荧光、免疫组织化学等方法，深入探讨脑缺血及再灌注损伤后CPXs的变化，明确其对脑缺血及再灌注损伤后SNARE复合体及谷氨酸释放的影响。结果显示，脑缺血后脑组织CPXⅠ和CPXⅡ的表达均显著升高，由于CPXⅡ主要定位于兴奋性神经突触，对于谷氨酸的释放具有更为重要的作用，本研究进一步使用携有靶向CPXⅡ-shRNA的慢病毒进行体内外基因敲低，进一步明确了CPXⅡ在缺血性脑损伤及SNARE复合体的装配及谷氨酸兴奋性神经毒性中的作用。本研究通过使用NOX2基因敲除动物以及RNA干扰等方法证明了缺血性脑损伤后CPXs的变化受NADPH氧化酶NOX2催化亚基介导的氧化应激反应调控。本课题首次揭示了CPXⅡ在缺血性脑损伤后谷氨酸介导的兴奋性神经毒性机制中的作用和分子生物学机制，有望为充实、完善缺血性脑损伤的病理生理学机制提供新的内容，并首次证明了该作用受NADPH氧化酶介导的氧化应激通路所调控，从而为临床防治缺血性脑血管病提供新的靶点和思路，具有重要的理论意义和实际应用价值。