H2A-Perforin融合蛋白对小鼠肝移植后免疫反应性的影响及机制

本课题“H2A-Perforin融合蛋白对小鼠肝移植后免疫反应性的影响及机制”原计划以穿孔素对T细胞的非特异性杀伤来达到预基因目的，基金开题论证过程中，相关专家建议采用生物学作用较为明确的CTLA4-IgG来取代穿孔素进行相关研究，最终的研究结果及目的并不与课题原始目标相违背。. 课题首先通过分子生物学手段，克隆了CTLA4、IgG2a以及在抗原决定簇H2Aa分子并经测序证实克隆的正确性。继而将上述分子亚克隆至原核表达载体形成H2Aa-CTLA4-IgG2a表达载体，并构建了H2Aa-100，H2Aa-200截短型表达载体，以筛选对免疫抑制最为有效的区域。将上述表达载体导入原核表达菌BL21中，施以ITPG成功诱导出了上述不同载体的原核表达蛋白，并利用HIS标签进行亲和纯化，成功获得系列目的蛋白。采用单向混合淋巴细胞反应的方法及3H胸腺嘧啶（3H-TdR）掺入法，以BALB/c小鼠T细胞为刺激细胞，昆明小鼠T细胞作为反应细胞，将纯化的H2Aa-CTLA4-IgG2A系列融合蛋白按不同浓度比例（0.1、0.5、1.0mmol三组）加入MLR体系，以不加融合蛋白为对照组，检测每组cpm值。数据显示，各组融合蛋白能明显抑制混合淋巴细胞反应，随着融合蛋白使用浓度的增强，对混合淋巴细胞反应的抑制作用越强，数据同时显示H2A全长融合蛋白对混合淋巴细胞反应的抑制作用最强。课题研究继而在动物水平进行观察，对肝脏移植手术组动物给予相应融合蛋白尾静脉注 射（2mg/30g体重，于术后即刻，1，3，5，7d共注射治疗5次），初步数据显示，H2Aa-CTLA4-IgG2A融合蛋白能显著延长移植物存活时间，单纯对照组动物存活时间为8d左右，CTLA4-IgG2A对照治疗组为12d左右，而实验治疗组则为22d左右，数据差异显著。对术后5天外周血抑制性T细胞水平检测数据显示，实验治疗组能使Treg细胞水平显著增高至60%左右（单纯手术组14%左右，对照治疗组30%左右），显示H2Aa-CTLA4-IgG2A融合蛋白对移植动物具有较好的免疫抑制作用。