一种新型自组装蛋白纯化方法的建立与优化研究

Protein purification is not only an essential step in the process of exploring the structure and function of specific protein, but also a necessary technical means in metabolic engineering field. In view of the problems of the current protein purification methods such as complicated operation steps, high cost and the operation process easy to arouse the denaturation of target protein, this project intends to establish a simple and novel self-assembly protein purification method which based on the combination of self-assembly protein and intein, and to realize high-efficiency purification of tag-free target protein, only centrifugation and self-cleavage steps are required. Subsequently, in order to establish a general self-assembly protein purification method, theoretical design and the relevant experiments would be conducted to screen the most universal connecting amino acid between intein and target protein, the linker between intein and CipA and the self-cleavage conditions. Finally, the method would be used as a tool to purify the enzymes in the biosynthetic pathway of isobutanol, and then the purified enzymes would be used to construct the in vitro isobutanol synthesis pathway. Thus, the high-efficiency production of isobutanol could be achieved and the application potential of this protein purification method could be demonstrated. This project provides new thoughts for the design and establishment of protein purification method and an effective tool for the in vitro synthesis of high-value compounds.

蛋白纯化是探究特定蛋白结构和功能过程中必不可少的步骤，同时是代谢工程领域研究的一种必需技术手段。针对目前蛋白纯化方法存在的例如步骤繁琐、成本高及操作过程易引起靶蛋白变性等诸多问题，本项目拟建立一种简便的新型自组装蛋白纯化方法，这种方法基于自组装蛋白和内含肽的相互结合，仅需离心和自裂解步骤即可实现无标签靶蛋白的高效率纯化。随后，通过理论设计和相关实验筛选普适性最佳的内含肽与靶蛋白之间的连接氨基酸、内含肽与CipA之间的连接肽及自裂解条件，最终建立一种通用的自组装蛋白纯化方法。最后，拟以此方法为工具纯化异丁醇合成途径中相关酶，构建异丁醇体外合成途径，实现其高效率生产，同时开发此方法的应用潜力。本项目为蛋白纯化方法的设计与建立提供了新思路，同时为高价值化合物的体外合成提供了有效工具。

蛋白质是生命活动的主要承担者，在探索生命本质的过程中，研究特定蛋白的结构与功能是不可或缺的基石。蛋白纯化是研究蛋白结构和功能的前提，同时是必不可少的步骤。常用的蛋白分离纯化方法是亲和纯化，其依赖于对亲和层析柱的使用。亲和纯化的成本高，与大规模生产不适配，同时得到的蛋白带有纯化标签，而纯化标签会影响靶蛋白活性。因此，为了节省蛋白纯化成本，简化纯化步骤，同时使靶蛋白维持原有特性，本项目设计开发了一种新型自组装蛋白纯化方法，此方法依赖于一种双功能纯化标签CipA-DnaB，此标签同时具有元件CipA的自组装功能和内含肽Ssp DnaB的自裂解功能，将此标签与靶蛋白融合，仅需离心和自裂解步骤即可快速纯化得到无标签靶蛋白，且靶蛋白能够保持原有活性。接着，为了提高此方法的纯化效率，优化了CipA与Ssp DnaB之间的连接肽和自裂解条件，结果显示利用柔性连接肽同时在裂解液中添加EDTA能够显著提高蛋白纯化效率。同时，本项目进一步探究了CipA对融合蛋白的组装特性，结果显示CipA可引导融合的GFP和RFP同时发生自组装，且GFP和RFP的原始活性可被保留。接着，利用CipA可组装融合蛋白的特性建立了多酶融合的自组装固定化策略，利用此策略实现了缬氨酸到异丁醛合成途径相关酶的自组装固定化。蛋白结构模拟结果显示组装后融合蛋白中的相关酶与游离酶的结构和催化机制一致，说明CipA未影响酶的正确折叠，酶可保持原始活性。与游离酶相比，自组装固定化酶具有更高的转化能力和热稳定性。此外，批次转化实验表明，使用多轮后回收的固定化酶具有与第一轮反应中固定化酶相近的转化能力。随后，通过搭建连续生产装置，同时将固定化酶装载到连续生产装置中，实现了异丁醛的高效体外连续生产。此项工作不仅开发了一种新型简易蛋白纯化方法，同时拓展了自组装元件的应用范围，为高值化合物的无细胞生物合成提供了范例。

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