IGFBP-3酶解片断1-98和1-212的IGF非依赖性作用及其在BMP信号通路中的作用研究

Genetic and clinical research observations suggest that the insulin-like growth factor (IGF) signaling pathway plays a fundamental role in regulating animal growth and development as well as in maintaining adult homeostasis. IGF binding protein-3 (IGFBP-3) is the major binding protein of IGFs in the bloodstream. IGFBP-3 is a multiple functional protein that has IGF-dependent and -independent actions in cultured mammalian cells. It has become widely appreciated that IGF-independent actions of IGFPB-3 contribute to improving the pathophysiology of human desease, such as cancer, diabetes, and malnutritions. Previously, we found that IGFBP-3 exerts its IGF-independent function by antagonizing BMP signaling in vitro and in vivo. Interestingly, two IGFBP-3 fragments, 1-98 and 1-212, were isolated from human hemofiltrate, and found that they have reduced IGF binding activity. But whether they have IGF-independent action and whether the can antagonizing BMP signaling in vitro and in vivo are still unknown. In this study, the IGF bind domain of IGFBP-3 fragment 1-98 and 1-212 will be mutated. The IGF- - independent action of the two fragments will be studied on PC-3 cells by determining the pro-apoptotic activities. The BMP ligand binding activity of the two fragments will be tested by ligand blotting. The in vitro and in vivo effect of the two fragments on BMP signaling will be investigated in U2OS cells and zebrafish model system, respectively. Eventually, we are going to reveal the physiological function and the mechanistic action of IGFPB-3 fragments. A better understanding of the molecular basis underlying IGFBP-3's actions will not only further our knowledge of IGFBP-3 physiology but may also lead to future strategies for diagnosing and treating or circumventing human diseases.

IGFBP-3是一种多功能蛋白，既有IGF依赖性和也有IGF非依赖性作用。申请人研究发现IGFBP-3的IGF非依赖性作用之一是通过结合BMP配体、抑制BMP信号的转导来实现。人体内存在两种天然的IGFBP-3的酶解片断1-98和1-212，它们与IGF结合能力有所减弱，但它们是否具有IGF非依赖性作用以及是否与BMP信号通路有关还不清楚。本项目将在PC-3细胞中研究两种IGFBP-3酶解片断的IGF非依赖性作用，用Ligand印迹确定这两种酶解片断与BMP配体的结合能力，在U2OS细胞以及模式动物斑马鱼中研究两种IGFBP-3酶解片断体外和体内对BMP信号转导的作用，比较IGFBP-3两种酶解片断与完整片断三者之间的功能异同。最终解析IGFBP-3酶解片断生理功能和作用机制。本项目的研究对我们进一步了解IGFBP-3的作用机制，以及IGFBP-3在临床上用于疾病的诊断和治疗具有指导意义。

IGF信号通路是一个在进化上相对保守的信号通路，在调节动物生长、发育和内稳态等方面发具重要作用。IGFBP-3是血液中含量最丰富的一种IGF结合蛋白，与血液中的IGF以及ALS形成三聚复合物，充当IGF的贮存库和延长IGF的半衰期。IGFBP-3还具有非依赖性作用，能进入细胞核且其N-端具有转录激活作用。IGFBP-3在体内能通过抑制BMP信号的转导来实现其IGF非依赖性作用。人体内存在两种天然的IGFBP-3的酶解片断1-98和1-212，它们是否具有IGF非依赖性作用以及是否与BMP信号通路有关还不清楚。本研究通过体外构建IGFBP-3的酶解片断1-98和1-212重组体，Ligand印迹结果显示IGFBP-3能与IGF-1结合，而其酶解片断1-98和1-212不能与IGF-1结合。细胞定位实验显示IGFBP-3能写位于细胞核，而酶解片断1-98和1-212由于没有NLS信号，1-212只能定位于细胞质，1-98由于片断较小能定位于整个细胞。IGFBP-3的N-端结构域具有转录激活作用，1-212也具有转录激活作用便活性较IGFBP-3的N-端结构域小，1-98无转录激活活性。体外细胞实验结果显示，IGFBP-3及其酶解片断1-98和1-212都能抑制IGF的增殖活性，说明IGFBP-3及其酶解片断1-98和1-212具有IGF非依赖性作用。体内实验结果显示，在斑马鱼中过表达IGFBP-3及其酶解片断1-98和1-212，能使斑马鱼胚胎背部化的能力依次为IGFBP-3、1-212、1-98。q-PCR结果显示，对BMP下游信号的抑制作用能力依次为IGFBP-3、1-212、1-98。说明IGFBP-3的其酶解片断1-98和1-212具有IGF非依赖性作用。已发表的结果显示，在第一次基因组倍增前只有一个IGFBP，它不能与IGF结合，但具有IGF非依赖性作用。我们从第一次基因组倍增后的七鳃鳗中克隆了一个IGFBP-3，发现七鳃鳗IGFBP-3能与IGF-1结合，并有IGF非依赖性作用。说明在进化上，IGFBP的IGF依赖性作用出现在IGF非依赖性作用后面。我们的研究结果解释了IGFBP-3及其酶解片断1-98和1-212的IGF依赖性作用及IGF非依赖性作用，1-98和1-212可能代表IGFBP-3的两种具有IGF非依赖性作用古老的蛋白而存在于体内。

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