功能性克隆大前庭导水管综合征耳聋新基因CA2及其分子致聋机制研究

Enlargement of the vestibular aqueduct (EVA) is one of the most common hereditary deafness, the disturbance of anion and PH in inner ear caused by mutation in anion transporter gene SLC26A4 may be responsible for the pathogenesis. In our preliminary results, two mutations in a potential EVA pathogenic gene CA2, carbonic anhydrase II gene catalyzing the formation of HCO3-, were identified in two EVA patients who also carried heterozygous SLC26A4 mutations. Our previous study also showed the function and transcriptional control of CA2 strongly correlated with SLC26A4. So, we propose the hypothesis: double-heterozygous mutation of CA2/SLC26A4 is likely to lead to the disturbance of HCO3- in inner ear and result in EVA deafness. To test this hypothesis, protein interaction and co-expression of CA2 and SLC26A4 in inner ear, interference on protein interaction of these two proteins and the catalytic activity of CA2 by CA2 mutation will be studied by co-immunoprecipitation and immunohistochemistry. Transcriptional control of CA2 and SLC26A4 in inner ear will be studied by Ca2-/- and Slc26a4-/- knockout mouse, respectively. EVA deafness caused by double-heterozygous mutation of CA2/SLC26A4 will be further verified by mutation screening of CA2 in large number of EVA patients and the analysis of clinical phenotypes in Ca2+/-;Slc264+/-double-heterozygous knockout mouse.This study is expected to provide us new theoretical basis and breakthrough for exploring the pathogenesis and treatment of EVA

大前庭水管综合征（EVA）是最常见的遗传性聋病之一，发病机制可能与SLC26A4突变所致的内耳离子环境紊乱有关。前期，我们在一个潜在的EVA新致病基因——催化生成HCO3-离子的碳酸酐酶II基因CA2中发现两例突变，在各自的EVA病例中分别与SLC26A4突变形成双基因杂合突变。我们的前期研究显示这两个基因在功能和转录调控上都紧密关联，CA2/SLC26A4双基因杂合突变极有可能共同引发内耳HCO3-离子平衡破坏而致聋。为验证该假说，我们将利用免疫共沉淀、免疫组化等方法研究二者蛋白的相互结合及内耳共表达情况，研究CA2突变对二者相互结合的干扰及对CA2酶催化活性的干扰；利用两个基因纯合敲除小鼠分别研究二者在内耳表达水平的内在联系；在更大样本量的EVA病例中进行CA2突变筛查，同时建立 双基因杂合敲除小鼠模型，验证其致聋模式。本项目有望为EVA的发病机制和治疗研究提供新的理论依据和突破方向。

EVA耳聋发病与SLC26A4突变相关，中国人群约80%能明确分子病因，其余病因不明，可能与CA2基因突变相关。项目实施过程中收集大量耳聋样本，其中EVA患者超过200例及部分耳聋遗传大家系。对EVA患者进行SLC26A4、KCNJ10、Foxi1及CA2等基因检测，发现了大量SLC26A4基因突变，进一步明确了中国EVA人群的分子病因和SLC26A4基因突变图谱。除此之外，未发现CA2等基因的任何可疑突变，CA2基因突变在EVA耳聋人群中的致聋性存疑,因而未进行进一步的深入研究。.对于新收集到的一个耳鸣性显性遗传耳聋大家系，利用全基因组连锁定位分析等方法，成功锁定致病染色体区域，并明确了EYA4基因c.1616+3A>T突变致病，为耳鸣性耳聋的致病原因提供了重要参考。对另外一个显性耳聋大家系进行了所有已知耳聋基因检测，未发现致病突变，新基因致病的可能性大，对9个样本连锁定位分析后最大LOD值为1.4，未能找到染色体致病区域，但进一步收集样本后可为后续克隆耳聋新基因提供重要线索。通过已知耳聋基因的定向捕获二代测序芯片对44个耳聋患者进行了144个耳聋基因的检测，利用统计学和基因型-表型共分离的分析方法，证实了二代测序可能会产生大量的假阳性数据，而对患者父母相关基因检测是一个排除假阳性结果的简单有效方法，同时证明了在散发耳聋患者中，显性耳聋基因的自发突变是非常罕见的，这一结论对耳聋患者的遗传病因探索具有重要的参考价值。.耳蜗存在血管-淋巴屏障，既往认为是一个无免疫应答器官。通过形态学研究显示，耳蜗不仅存在巨噬细胞，而且在小鼠耳蜗的发育过程中其分布和形态发生巨大变化，这可能在耳蜗的成熟和重塑中起作用。随后，建立急性中耳炎小鼠模型，发现中耳炎症能导致内耳大量巨噬细胞的集聚和炎症因子的升高，TRPV1基因表达升高，内耳毛细胞对氨基糖苷药物吸收增加。另外，慢性中耳炎小鼠模型能导致感音神经性耳聋，而DRAC-/-（Duffy趋化因子抗原受体）敲除小鼠能明显减缓感音神经性耳的发生。该结果在一定程度上揭示了中耳炎与内耳损伤之间的联系，对该病的治疗方案提供了参考价值。

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