UDP-葡萄糖基转移酶底物化学选择性的精准调控

UDP-glucosyltransferase plays an important role in regulating the function of plant natural products by introducing proper O-glycosylation modification, however, the poor chemoselectivity of UDP-glucosyltransferase results in the uncontrollability in terms of the position and number of the transferred sugars, thus decreasing the modification effectiveness. Herein, in this project, the enzymatic O-glycosylation of glycyrrhetinic acid (GA) is chosen as a model reaction system, and two special UDP-glucosyltransferases BvEc and Unigene20323 are taken as model enzymes which can consecutively transfer two glucose moieties to the hydroxyl and carboxyl groups of GA via different reaction pathways. Firstly, the crystal structures of the two enzymes in complex with substrate under different reaction states are resolved, in combination with molecular dynamics simulation, the substrate recognition and chemoselectivity towards the hydroxyl and carboxyl groups are uncovered. The dynamic conformation motion during consecutive glycosylation is illustrated. Furthermore, the chemoselectivity is manipulated based on rational design to realize the precise glycosylation modification of GA. This study can solve the problem of uncontrollable O-glycosylation process resulted from the poor chemoselectivity of UDP-glycosyltransferase, and provides new insight into the engineering of other substrate selectivity of UDP-glucosyltransferase based on rational design.

UDP-葡萄糖基转移酶对植物天然产物的适度O-糖基化改性是调控其功能的重要手段，然而该类酶的底物化学选择性差导致糖基修饰位置和数量不可控，降低了改性效果。为此，本项目以酶法O-糖基化修饰甘草次酸以提高其活性为反应体系，针对UDP-葡萄糖基转移酶BvEc和Unigene20323对甘草次酸的羟基和羧基可连续转移糖基且位点不专一的催化特点，通过解析不同反应状态下酶和底物复合物的晶体结构，结合分子动力学模拟，以“静动结合”的手段揭示其底物结构的识别机制及其化学选择性机理，探讨两种酶对羟基和羧基偏好性差异的分子机制，阐明其连续转移糖基过程中的结构动态转换机制，并通过理性设计分子改造调控其化学选择性，实现其对甘草次酸类化合物的精准O-糖基化修饰。项目的研究将有效解决UDP-葡萄糖基转移酶催化O-糖基化过程中的化学选择性差导致反应不可控的问题，同时为理性改造该类酶的其它底物选择性提供新思路和新方法。

O-糖基化对天然产物的活性、溶解度以及生物利用度具有重要的调节作用，该过程主要通过UDP-糖基转移酶的催化实现。但目前报道的很多UDP-糖基转移酶化学选择性杂泛，导致糖基修饰位置和数量不可控，难以实现对天然产物的精准糖基修饰；而影响其化学选择性的分子机制不明，使得对其进行分子改造缺乏依据。为此，本项目以甘草次酸及其衍生物为目标化合物，在甘草中挖掘具有特异催化功能的UDP-糖基转移酶，阐明UDP-糖基转移酶的底物识别机制，鉴定影响底物化学选择性的关键氨基酸区域，揭示化学选择性机制，进行理性设计的分子改造，实现对不同骨架的底物进行定向糖基修饰，构建高效的糖基化反应体系，实现天然产物糖苷化合物的体外高效合成，取得主要结果如下：（1）对光果甘草和乌拉尔甘草的基因组进行分析，系统梳理UDP-糖基转移酶种类，通过基因克隆与原核表达，以典型三萜类化合物为底物，对UDP-糖基转移酶进行体外催化功能鉴定,首次获得UGT73F24、UGT73F29、UGT73C33、UGT73P29、UGT73P30等5个UDP-糖基转移酶，可以催化甘草次酸及衍生物的特异性糖基修饰。（2）鉴定了由13个氨基酸组成的K-region，其对UGT73家族UDP-糖基转移酶的底物化学选择性具有显著影响，通过对K-region的分子改造实现了区域选择性的调控。分子对接和分子动力学模揭示K-region对于底物的识别、结合和稳定起到重要作用，进而影响了酶的化学选择性。（3）首次挖掘了甘草中的蔗糖合酶，通过理性设计提高了蔗糖合酶的稳定性，由此构建了高效的UDP循环体系，实现了以蔗糖为糖基供体高效合成五环三萜糖苷化合物。上述研究成果发表论文16篇、其中SCI论文14篇，申请国家发明专利3项；培养博士研究生2人，硕士研究生6人。

内容获取失败，请点击重试