关键转录因子HoxA10在子宫内膜容受性建立过程中的调控网络及分子机制研究

The homobox gene HoxA10 plays essential roles in the establishment of endometrial receptivity, and therefore, is a star molecule widely studied in the field of assisted reproduction. Until now, little is known about the molecular mechanisms of HoxA10 in the regulation of endometrial receptivity, so systematical and integrated research on HoxA10 regulation will be needed. In this project, we plan to clarify HoxA10’s regulatory mechanisms in human endometrial epithelial cells and stroma cells during the window of implantation from different levels. We will firstly search HoxA10 regulated genes and lncRNAs using RNA-seq method and then globally map the HoxA10 binding sites using ChIP-seq and identify HoxA10 direct target genes and lncRNAs in human endometrium. Finally, systematic bioinformatics analysis and multiple molecular biology and cell biology methods-coimmunoprecipitation，gel shift assay, luciferase assay, real time PCR, overexpression and RNAi will be conducted and integrated to decipher the detailed molecular mechanisms and signal network applied by HoxA10. Collectively, our results will shed new light on the clinical diagnosis and treatment for repeated implantation failure and the regulation of fertility.

同源框基因HoxA10对子宫内膜容受性的建立起主导作用，是目前辅助生殖领域研究的热点分子，但是其调控内膜容受性的具体机制至今仍所知甚少，尚缺乏系统性，整合性的研究。本项目利用原代培养的种植窗口期子宫内膜上皮细胞和间质细胞模型，首先，通过RNA-seq研究HoxA10调控的基因及长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA），其次，通过ChIP-seq 鉴定HoxA10的全基因组水平的结合位点，明确HoxA10的直接靶基因和lncRNA，再次，在生物信息学分析的基础上，通过免疫共沉淀，凝胶阻滞分析，荧光素酶报告基因检测，real time PCR，基因过表达以及RNAi等多种分子生物学和细胞生物学的方法，阐明HoxA10在上皮细胞和间质细胞内发挥调控作用的信号网络及分子机制，并探究细胞特异的调控机制。本项目有望为反复种植失败的临床诊疗及生殖调控提供新靶点和新线索。

良好的子宫内膜容受性是胚胎成功着床的先决条件。在辅助生殖治疗中，鉴定并阐明与子宫内膜容受性相关的新的关键分子对于更好地理解胚胎着床和提高妊娠率至关重要。本项目中，我们主要从两个方面来研究内膜容受性相关的分子。第一方面，我们首次利用iTRAQ定量蛋白质组学技术发现并鉴定了173个在LH+2和LH+7子宫内膜差异表达的蛋白质。此外，我们还首次进行了蛋白质组和转录组的综合分析，发现差异显著的基因和蛋白的表达仅呈现有限的正相关性。我们鉴定了63个新的在着床前期和着床期子宫内膜的mRNA和蛋白质水平上均有差异表达的基因。通过GO，pathway和蛋白质相互作用（PPI）网络分析，确定了ACSL4、ACSL5、COL1A1、PTGS1和PLA2G4F五种核心关键蛋白。其中的ACSL4蛋白在着床期子宫内膜较着床前期子宫内膜显著上调，且在腺肌症患者中显著下调，暗示ACSL4可能与腺肌症导致的内膜容受性低下有关。第二方面，同源框基因HoxA10对子宫内膜容受性的建立起关键作用，但是其具体的调控机制至今仍所知甚少，尚缺乏系统性，整合性的研究。我们利用原代培养的子宫内膜间质细胞模型，首先，通过RNAi 偶联RNA-seq 的方法检测了HoxA10 在子宫内膜间质细胞内调控的基因，发现有1830个转录本显示了差异表达（P<0.01，变化倍数>2），分别有980和850个转录本受HoxA10的上调和下调。Pathway分析表明，这些差异基因多与代谢过程相关，包括能量，脂质以及氨基酸的代谢。同时很多与信号转导，蛋白处理，转运和催化相关的通路也得到了富集。其次，我们用ChIP-PCR及ChIP-qPCR检测了已经报道的4个HoxA10 的结合位点在体内与HoxA10 的结合情况，结果发现，这些位点中，有两个（KLF9和EMX2相关联的位点）在体内是被HoxA10结合的，另外两个（PCAF和ITGB3相关联的位点）并不被HoxA10所结合。此外，我们的数据还表明，HoxA10很有可能通过与雌激素受体的直接相互作用来协同调控基因的表达。本项目的研究结果将为阐明子宫内膜容受性的分子机制及生殖调控提供新靶点和新线索。

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