基于荧光素酶的蛋白质与核酸相互作用分子传感器

蛋白质－核酸相互作用涉及到许多重要的细胞内反应，是生命科学研究的前沿和热点。在蛋白质与核酸相互作用的研究中和一些药物筛选中，常常需要简单、高通量的方法来测定蛋白质与核酸的相互作用以及测定药物分子对核酸与蛋白质之间相互作用的影响。结合了信号识别与信号传导的分子传感器被认为是一种理想的测定蛋白质与核酸相互作用的方法。本申请拟构建一种新的基于ATP扩散限制原理的荧光素酶分子传感器，用于蛋白质-核酸相互作用的检测和研究。这种方法具有简便易行，不依赖大型仪器和抗体，成本低，步骤少，速度快，信号强等优点。与荧光分子相比，荧光素酶的发光效率高，不需要激发光，背景噪音低，对细胞光毒性小，有可能为蛋白质与核酸相互作用的研究提供新的快速、简便、灵敏检测手段，具有重要的学术意义与应用价值。

经过三年的研究，我们基本完成了该项目，尽管研究过程中也遇到了一些未预见到的困难。在热稳定和高活性萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）以及生物发光共振能量转移传感器（Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET）方面取得了多项进展，获得了一项专利授权，发表了两篇文章。通过对野生型萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）进行热稳定性和酶活性组合突变，得到了一种在热稳定性和酶活性方面都比野生型酶得到了很大提高的萤火虫荧光素酶（Luc4）,该酶在39摄氏度保温20分钟后，还能保持80%的活力，而野生型酶只有不到2%的原活力。该研究为基于萤火虫荧光素酶的传感器研究打下了物质基础，获得了一项发明专利（ZL201110093484.5）。在BRET研究方面，发表论文2篇，一个工作为将新型纳米粒子富勒烯衍生物引入作为BRET的受体，与Gaussia荧光素酶（hGluc）连接，利用富勒烯的极强的接受电子能力，发展了一种高灵敏的BRET蛋白酶传感器（与传统的BRET方法比较，检出限提高了20倍以上），结果发表在Chemical Communication, 2012, 48, 11011。另外，针对许多蛋白酶的最佳反应条件与BRET信号最佳测定条件不一致的问题，我们研制了一种增强缓冲液，显著提高了BRET蛋白酶传感器的灵敏度（提高十倍以上），结果发表在Analytica Chimica Acta, 2012, 724, 104。更进一步地，我们优化了BRET体系供体受体对，以发光强度高且稳定的hGluc作为供体，发射峰与hGluc发射峰相隔较远的tdTomato作为受体，将BRET蛋白酶传感器的检测性能大大提高，检出限相对于先前的BRET体系提高了30倍以上，结果发表在Talanta, 2103,109,141-146。上述这些研究结果为蛋白酶的检测提供了更好更灵敏的BRET检测方法。但在研究过程中，也发现核酸对计划研究的荧光素酶-ATP传感体系有比较大的影响，给研究蛋白质-核酸相互作用的传感器带来了不利影响，基于该体系的均相传感器可能只适合检测强蛋白质与DNA之间的强相互作用，对于弱相互作用由于多因素的影响，信号变异大。

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