DLBCL中PI3K催化亚单位异常及其在Akt活化中作用的研究

Akt/mTOR 信号传导途径在弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中有组成性激活，并可望成为DLBCL治疗的新靶点，但其活化机制尚不清楚。本课题以PI3K催化亚单位中的PIK3CB和PIK3CG基因为研究目标，首先在DLBCL组织中检测PIK3CB基因扩增及其与蛋白和mRNA表达的关系；同时观察PIK3CG的蛋白和mRNA表达与该基因拷贝数异常和启动子甲基化的关系；分析两者与DLBCL分型和Akt活性的相关性；然后在体外分析DLBCL细胞株中PIK3CB和PIK3CG基因状态及表达水平，进一步通过基因转染、RNAi和去甲基化等多种手段证实PIK3CB和PIK3CG基因异常对DLBCL中Akt活性及细胞生物学行为的影响。通过上述研究，将明确DLBCL中 PI3K介导的Akt活化机制及与DLBCL分子分型、细胞生物学行为的关系，并为针对PI3K/Akt信号通路更精确位点的靶向药物应用提供依据。

本课题分别从体内外对DLBCL中PI3K各亚单位DNA拷贝数、mRNA和蛋白表达、抑制PI3K及亚单位对pAKT和生物学行为的影响等进行了系列研究，主要研究结果如下：(1)采用高通量Nanostring平台检测DLBCL中PI3K主要催化亚单位和调节亚单位及其下游AKT亚单位等基因的拷贝数改变（copy number variation, CNV）。其中PIK3CA扩增率15%、PIK3CB 15%、PIK3CD 9%、PIK3CG 12%，AKT1，2，3 均为15%。（2）采用real-time PCR分析DLBCL中PIK3CA、B、D、G基因的mRNA表达， 结果是DLBCL中PIK3CD的表达水平最高，其次为PIK3CB，表达最低的是PIK3CG。PIK3CB、PIK3CD和PIK3CG在AKT的活化中都可能发挥作用。(3)免疫组化的方法检测PI3K亚单位蛋白表达情况：4个催化亚单位PIK3CA，PIK3CB，PIK3CD，PIK3CG和1个调节亚单位PIK3R1在DLBCL中阳性表达率分别是89.47%，74.19%，90.38%，80.9%和87.5%，其与临床病理指标均没有显著相关性；阳性组较阴性组预后较差，生存期较短，但差异没有显著性（p>0.05）。(3)在6个DLBCL细胞株中，PIK3CD高表达，显著高于其他亚单位。使用慢病毒介导的质粒载体对DLBCL细胞株LY8的PIK3CD细胞内表达沉默，并通过流式细胞分选获得PIK3CD基因沉默的稳转细胞株，进一步研究对细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡等生物学行为和肿瘤生长的影响。(4)建立了人DLBCL细胞株LY8裸鼠皮下移植瘤模型并观察其生长特性，证实了其生长的稳定性和可重复性。(5)PI3K选择性抑制剂LY294002对人DLBCL荷瘤鼠皮下移植肿瘤生长显示出明显的抗肿瘤效应，且呈时间依赖性，LY294002在体内抑制了AKT的磷酸化水平。（6）PI3K抑制剂与化疗药物DOX具有协同作用。（7）FOXP1在结内和结外的表达与肿瘤的形成密切相关。FOXP1在BCL2表达的non-GCB DLBCL的肿瘤形成中发挥重要作用。（8）TNFAIP8 rs1045241C>T在中国人NHL的易感性方面发挥重要作用。本研究结果对了解PI3K各亚单位在DLBCL发生机制中的作用及其靶向治疗中的潜在价值具有重要意义。

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