SOX9 基因上游67-kb区域内与性别决定相关调控序列的功能研究

46,XX disorder of sex development (46,XX DSD) is a rare genetic disorder, the genetic causes for SRY-negative patient (which accounts for 10% in 46,XX DSD) remain unknown. Our group collect a SRY negative male with 46,XX disorder of sex development, we have excluded currently known genes by mutation screening the 46,XX DSD associated genes. Genome wide copy number changes were analyzed by running on whole genome array analysis and real-time PCR, we identified a 74-kb duplication in a region upstream of 584-510 kb region. Combined with the results of the previous studies, the minimal critical region of sex determination is a 67-kb region located 584-517kb upstreame of SOX9. The amplification of this region might lead to SOX9 overexpression, causing female-to-male sex reversal. Gonadal-specific enhancers in the region upstream of SOX9 may activate the SOX9 expression through long-range regulation, thus triggering testicular differentiation. We plan to discover the regulatory elements in vivo and anaminal model which is associated with SOX9 expression, thus enrich the sex determination mechanism, and also provide experience for the molecular study of 46,XX DSD.

46，XX性别发育异常（46，XX-DSD）属于一类少见的遗传性疾病，其中SRY阴性病例占10%，分子病因仍不明确。我们课题组于前期研究中收集了一SRY 阴性的46，XX-DSD病例，对已经报道的与此病相关的3个基因进行突变检测，均未发现异常。在此基础上，进一步应用全基因组芯片及实时定量PCR技术检测发现在SOX9基因上游584-510 kb调控区存在一 74 kb的重复，结合之前的报道，通过基因型表型分析将最小性别决定区域锁定在SOX9基因上游584–517 kb处的67-kb的区域内。因此，我们设想此扩增区域存在潜在的性腺特异调控序列，通过远距离调控的方式影响SOX9基因的表达，从而导致疾病的发生。以此为切入点，通过体外细胞水平及动物实验深入研究此区域内潜在调控序列对SOX9表达的调控方式，从而丰富性别决定机理；并探索建立46，XX DSD的分子病因研究体系.

我们课题组于前期研究中收集了一SRY 阴性的46，XX-DSD的病例，应用高通量的芯片技术检测发现在SOX9基因上游调控区存在一 74 kb的重复，结合之前的报道，通过基因型表型分析将46，XX DSD性别决定区域锁定在SOX9基因上游584–517 kb处的67-kb的区域内。2017年一篇报道将此关键区域缩小并锁定在SOX9基因上游584–559 kb 25 kb的区域中。本课题旨在通过体外实验寻找位于此关键区域内的潜在调控元件。我们首先应用生物信息学方法预测位于此区域内的潜在调控区域， 然后通过体外构建调控序列-启动子-荧光素酶表达载体，转染真核细胞从而检测荧光素酶活性寻找调控增强子。ECR在线预测结合ENCODE预测确定此区域内存在4条潜在调控序列。利用pGL3-basic荧光素酶载体构建获取待测DNA片段的荧光素酶质粒，与pRL-TK海参荧光素酶质粒共转NT2/D1细胞，在NT2/D1细胞中验证待测DNA片段的启动子活性。转染48h后进行荧光素酶活性检测， 结果发现，同单纯启动子相比，调控序列4可以在NT2/D1细胞中上调启动子活性。接下来将调控序列4同时 转染HEK293，TM4、NT2 细胞， 发现调控序列4在NT2/D1细胞中可以上调启动子活性,但在HEK293，TM4细胞系中未见明显的活性上调。同时在此项目执行过程中，我们建立了46,XX DSD的临床评估和常见遗传学病因的筛查技术体系，为46,XX DSD病例分子病因的筛查提供了检测平台。在此基础上，建立了高通量的拷贝数变异筛查平台，并常规应用于46,XXDSD分子病因的检测。同时我们发展了全外显子组测序，实现对46,XX病例已知遗传学病因的有序筛查和未知致病基因的发掘和分离，提高46,XX性反转的分子病因诊断率，并且为新基因克隆的可持续发展奠定基础。经过以上常规流程筛查，我们收集了六例病因不明的46,XX DSD病例。

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