辣椒育性恢复基因诱导表达的重要候选基因克隆与功能分析

以辣椒不育系、保持系、恢复系（近等基因系）为试验材料，利用SSH、cDNA-AFLP技术构建了4个育性相关基因表达差异EST和TDFs库。根据功能注释、表达差异和在各库中的表达情况，筛选得到7个可能与育性相关的候选基因。利用RACE技术对7个基因进行全长cDNA 克隆，并利用半定量RT-PCR 和荧光定量PCR技术检测了7个基因在辣椒不同器官上的表达特性。这7个基因均只在可育株上表达或可育株的表达量明显高于不育株，并且在花器官上特异表达，花药中表达量更高。其中PAP3（AP3/DEF）、PPI（PI/GLO）基因属花器官发育MADS-box基因家族B类功能基因，直接控制花瓣和雄蕊的形成，CaSEP1 是B类和C类基因行使功能所必须的基因；CaPROF基因是前纤维蛋白基因，主要参与调控肌动蛋白聚合形成微丝，可能参与花粉细胞骨架调节而影响雄蕊育性；CaOle e 6基因功能目前还不清楚，但仅在花药中表达；CaPCP基因是花粉外壁蛋白基因，可能通过影响花粉外壁蛋白的形成而影响雄蕊育性；CaNAC基因是花药特异表达基因，可能与花药发育相关。. 对PAP3和PPI基因功能采用VIGS技术进行验证，结果表明沉默PAP3或PPI基因，花药中基因表达量明显的降低，造成辣椒花药退化，无花粉粒，导致雄性不育，说明PAP3和PPI基因均有调控辣椒花药形成的功能；通过酵母双杂交，体外GST-Pull down验证了PAP3和PPI两个蛋白之间存在互作关系；半定量RT-PCR及荧光定量qPCR、RNA原位杂交结果均表明，PAP3基因在花药发育的后期表达量增高，在恢复系中的表达量高于不育系，推测PAP3基因在花药发育的后期起到重要的作用，并且在不育系中的表达可能受到了抑制。同时，RNA原位杂交显示，PAP3基因具有B类基因的表达特性，即在雄蕊、花瓣内高丰度表达，以雄蕊表达最高；在雌蕊中也有不同程度的表达，而在萼片中没有表达。洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示，PAP3蛋白定位于细胞核，符合MADS-BOX基因家族转录因子的表达特性。. 通过本项目研究初步证明了与花器官形成有的PAP3和PPI基因可以调控辣椒花药的形成，抑制其表达可造成花药退化，造成辣椒雄性不育，并探讨了PAP3基因表达的分子机理，为从基因水平调控辣椒育性提供了理论依据，同时为其他植物育性研究和性别调控提供借鉴。