拟南芥NRG2调控硝态氮信号的分子机理研究

Studying the regulation and mechanisms of nitrate absorption in plants is of great importance for improving the use efficiency of nitrate and reducing its pollution to the environment. But the nitrate regulatory genes and their working mechanisms remain poorly understood. Recently we identified a novel nitrate regulatory gene NRG2, which plays a key role in nitrate regulation. NRG2 modulates the expression of NRT1.1 and works upstream of NRT1.1. It also controls the expression of some genes related to nitrate transport, assimilation, and response. However, the underlining mechanism is still unclear. This project aims to investigate the DNA binding ability and transcriptional activity of NRG2 by using different techniques and methods (such as ChIP-qPCR, ChIP-sequencing, protoplast transient assay). The NRG2 targeting genes and cis elements related to nitrate will be characterized. LncRNA-sequencing analysis will be performed and the results, together with the data of ChIP-sequencing analysis, will be analyzed to identify the LncRNAs to which NRG2 directly binds. Further characterization on these LncRNAs will reveal their roles in nitrate signaling. Thus, this project will illustrate the functions of NRG2 as a transcription factor and the molecular mechanisms of NRG2 in regulating nitrate signaling and the LncRNAs involved in nitrate regulation that NRG2 targets will be identified. These findings will effectively promote the dissection of the mechanisms of nitrate regulation and molecular network and provide theoretical basis for improving the nitrate use efficiency of crops.

研究植物对氮素的吸收利用规律和机制对于提高作物的氮素利用率、减少环境污染意义重大，但目前对硝态氮调控基因及其作用机理的研究还十分缺乏。我们最近通过正向遗传学方法发现并鉴定了一个重要的硝态氮调控基因NRG2，该基因调控NRT1.1的表达并作用于NRT1.1的上游，影响部分与硝态氮转运、同化及响应等相关基因的表达，但其对下游基因的调节机制尚不清楚。本项目拟在上述研究的基础上，采用多种技术和方法研究NRG2结合DNA的功能及其转录调控活性，并鉴定出NRG2结合的与氮素代谢相关的靶基因及顺式作用元件。进行LncRNA-sequencing分析，结合ChIP-sequencing的结果找出NRG2直接调控的LncRNA，并对其进行功能鉴定，明确LncRNA在硝态氮信号调控途径中的作用。预期结果将为解析植物硝态氮调控的机制及分子网络奠定基础，为作物的氮素高效利用提供理论依据。

研究植物对氮素的吸收利用规律和机制对于提高作物的氮素利用率、减少环境污染意义重大，但目前对NO3-调控基因及其作用机理的研究还十分缺乏。我们前期通过正向遗传学方法发现并鉴定了一个重要的硝态氮调控基因NRG2，该基因在硝态氮调控途径中作用于NRT1.1的上游并调控NRT1.1的表达，该基因突变会导致植物对硝态氮吸收和转运下降。.本项目利用体内的ChIP-qPCR及ChIP-PCR实验证明NRG2可以和NRT1.1基因的启动子结合，但ChIP-seq的结果却显示NRG2没有结合基因启动子的功能，目前正在验证这一结果。同时，通过 ChIP-qPCR 和 ChIP-PCR 实验均发现 NLP7能够结合 NRT1.1 启动子。通过对NRG2蛋白的酵母文库筛选，我们也成功筛选到3个NRG2互作蛋白，正在进行这3个蛋白在NO3-信号通路中的调控作用的功能鉴定研究，这部分内容是对本项目的进一步拓展。.我们利用RNA-seq测序以及qPCR鉴定到一个受NO3-强烈诱导的lncRNA T5120。qPCR检测发现T5120过表达系中NO3-响应基因的表达明显升高，表明T5120能调控植物对NO3-的响应；生理检测发现T5120过表达系的NO3-含量显著降低，而硝酸还原酶（NR）活性和氨基酸含量明显升高，对NO3-的吸收不变，说明过表达系中NO3-含量降低是由于同化作用增强造成的。分子水平的检测结果表明，T5120过表达系中部分NO3-同化基因的表达量显著增加。上述结果说明T5120能促进植物对NO3-的初级响应和同化利用。进一步分析T5120的启动子序列，发现其启动子区存在一个NO3-响应（NRE-like）元件；随后利用Y1H和ChIP-qPCR技术进行鉴定，结果显示NLP7可以结合T5120的启动子，双荧光素酶报告系统分析表明NLP7可以激活T5120的转录，进一步的研究发现NLP7可以调控T5120的表达和NO3-诱导量，这些结果说明NLP7可以直接结合T5120并调控其表达。同时，我们发现T5120能够促进植物的生长。.以上结果为进一步解析植物硝态氮调控的机制及完善分子调控网络奠定基础，为作物的氮素高效利用提供了理论依据。

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