嗜热菌Thermus thermophilus HB8铁硫簇SUF合成途径的研究

铁硫簇是一种古老且很重要的无机辅因子，广泛存在于各种基础生命活动中，在细胞的生物学过程中起着重要的作用，可参与电子传递和基因调节等过程。现已发现细菌中主要铁硫簇合成途径有三种类型，即为ISC，NIF和SUF系统。ISC系统由iscSUA-hscBA-fdx基因串编码，合成的是一类“管家”蛋白，适于在正常条件下表达。NIF系统由nifSU基因编码，适于固氮酶（厌氧条件下起作用）铁硫簇的合成。SUF系统由基因串sufABCDSE编码，常在恶劣环境如氧化应激和铁饥饿条件下表达。但是在Thermus thermophiles HB8 中存在较为完整的而且唯一的SUF体系，是进行铁硫簇SUF合成途径研究的很好材料。SUF途径主要包括sufABCDSE这样一个基因簇，分别编码SufA、SufB、SufC、SufD、SufS和SufE这六种蛋白。.本课题以Thermus thermophiles HB8全基因组为模板，通过PCR技术，分别获得sufA、sufB、sufC、sufD、sufS、sufE基因，并成功将目的基因分别连接到表达载体pET28a(+)和pGEX-6P-1上，构建重组质粒。重组质粒转化E.coli BL21后，获得大量表达，通过亲和层析与蛋白凝胶过滤层析等方法将其分别纯化。并通过共表达和共转化等方法成功表达复合体SufBC、SufCD、SufBCD蛋白。.对蛋白的功能研究表明：SufS具有半胱氨酸脱硫酶活性，SufE没有脱硫酶活性，但SufE存在会使SufS活性增强，摸索体外重组的条件发现在60 ℃孵育1.0-2.5 h效果比较好，其活性是单体SufS的2倍左右；SufC蛋白具有ATP水解酶活性，使用一个三偶联的方法测定SufC ATPase活性。 SufC可以与SufB，SufD相互作用形成复合体SufBC，SufCD，SufBCD。这些复合体的形成均可以提高SufC ATPase活性。同时在复合体SufBCD 存在时，SufS半胱氨酸脱硫酶的活性也被提高。.体外重组实验表明：SufS与SufE可在体外重组为复合体，但是通过非共价键连接的，暂时的，不利于复合体的获取。而通过交联剂Mts-Atf-Biotin使SufS与SufE共价交联后，不仅复合体SufSE稳定性增加，而且半胱氨酸脱硫酶的活性亦大大增加，此时SufSE酶活性是单体的6倍左右，活性可持续72小