大肠杆菌中植物CPR:P450模块化自主共价连接系统的构建及其在咖啡酸合成中的应用

Functional expression of plant enzymes in microbial hosts is critical for constructing plant natural product cell factory. Plant cytochrome P450 enzyme, belonging to monooxygenase family, participates in biosynthesis of many plant natural products, and accepts electron from its redox partner cytochrome P450 reductase (CPR) when catalyzing enzymatic reactions. In Escherichia coli, protein fusion strategy can achieve electron transport between plant P450 and CPR. However, modular expression system of plant P450 needs to be developed due to complex construction process and difficult regulation of the above protein fusion strategy. Based on the obtained CPR and P450 involved in caffeic acid biosynthesis of medicinal plant Lycoris aurea, the system of autocatalytically covalent-linked protein domain will be first built for auto-forming covalent complex of modular expressed P450 and CPR at the post-translational level. And then, the mechanism of forming electron transport channel between CPR and P450 would be uncovered by researching the function, activity and structure of the auto-formed CPR:P450 complex via enzymatic method, electron transport rate analysis and protein homologous modeling. Finally, the Escherichia coli fitted plant P450 expression system will be achieved after optimization and used to constructing caffeic acid cell factory. Together, these results would develop a new expression strategy of plant P450 in Escherichia coli, and offer many modular tools for autonomous covalent-linkage between protein and protein and construction of metabolic channel and electron transport channel in metabolic engineering.

植物酶在微生物中的功能性表达是构建植物天然产物细胞工厂的关键。植物P450是参与大量天然产物生物合成的一类单加氧酶，其催化的反应都需要CPR蛋白提供电子。大肠杆菌中，蛋白质融合策略可以实现CPR与P450间的电子传递，然而构建复杂和调控困难，需要建立模块化的植物P450表达系统。为此，本研究拟在获得的忽地笑CPR和咖啡酸合成P450的基础上，通过开发自催化分子间共价连接的蛋白质结构域系统，实现CPR和P450在翻译后水平上自主形成共价复合物；进一步利用酶学、电子传递速率分析和蛋白同源建模等方法，研究CPR:P450自主共价连接复合物的功能、活性与结构，以揭示其电子传递通道的形成机制；并且优化获得大肠杆菌适配性的植物P450模块化表达系统，进而利用其构建咖啡酸细胞工厂。本研究将为植物P450开发一种新的表达策略，为代谢工程中蛋白质自主共价连接与电子传递通道和代谢通道的构建提供新的模块化工具。

植物来源的酶在微生物中的功能性表达是构建植物天然产物细胞工厂的关键。植物P450是参与大量天然产物生物合成的一类单加氧酶，其催化的反应都需要其分子伴侣CPR蛋白提供电子。植物P450和CPR蛋白通常共定位在内质网膜细胞质一侧。大肠杆菌中，蛋白质融合策略可以实现CPR与P450间的电子传递，然而当天然产物的生物合成途径涉及多个P450时，例如紫杉醇的生物合成至少需要8个P450的参与，这时，融合基因的构建及融合蛋白的表达调控就会非常复杂而困难。.本研究建立了一种模块化的、自装配的植物P450功能性表达系统。首先，本研究通过在大肠杆菌中构建植物苯丙烷途径，发现蛋白质空间架构对CYP73A的p-香豆酸生物合成性能具有重要的影响；其次，利用自装配的蛋白质结构域系统，实现了P450和CPR在翻译后水平上自主形成复合物，并对复合物的空间架构进行了调控；再次，利用从头合成的方法，研究了P450:CPR复合物的功能与性能，发现N-端桥连的P450-CPR共价复合物具有优秀而稳健的p-香豆酸生物合成性能；进而，通过多肽的交叉融合方法，证明P450-CPR复合物的构型影响P450的生物合成性能，并优化获得了大肠杆菌适配性的植物P450模块化表达系统，构建了咖啡酸细胞工厂；进一步，通过同源建模和分子对接的方法，初步揭示了P450-CPR复合物中电子传递通道的形成机制。.本研究为植物P450开发了一种新的表达策略，为代谢工程中蛋白质自主装配与电子传递通道和代谢通道的构建提供了一种新的研究手段。

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