提高由芯片合成的寡核苷酸及其组装而成的基因DNA的保真性

The development of economical and high-throughput de novo gene synthesis has been limited by the high errors in the synthesized DNA, and the error correction is a time and labor cost procedure. Oligonucleotide synthesis on Chip can reduce the cost for oligonucleotide greatly, but the low quality of synthesized oligonucleotide needs more error correction. In this project, two kinds of mismatch DNA binding proteins MutS are used in a method to correct the error in Chip synthesized oligonucleotides. The MutS are fused with CBM3 and EGFP to improve the expression and purification. The oligonucleotides synthesized by traditional method are used to construct the DS-DNA with various mismatchs for validation of the MutS function. And also these DS-DNA are also used to optimize the two kinds of MutS composition and the procedure of error correction. Then the constructed procedure is used in the error correction of the oligonucleotides for gene assemble, and high throughput error correction method will also been evaluated in the oligonucleotides for more and longer genes. Further more, the error correction for DNA fragment will be constructed. In this project, a high throughput error correction will be constructed for oligonucleotides and DNA fragment. It will be an important fundament for high throughput DNA synthesis.

随着合成生物学等学科的发展，几十Kb，几百Kb长度的DNA的化学合成需求越来越大，但是基因DNA合成的高成本限制了此技术大范围的应用。在基因DNA的合成中，错误的测定和纠正是费用高昂的主要原因之一。通过芯片合成寡核苷酸可以大规模降低寡核苷酸合成成本，但难以降低错误的测定和纠正的费用。本课题针对此问题，采用错配结合蛋白MutS结合并去除有错寡核苷酸及DNA短片段的策略来大幅提高基因合成的保真性。通过克隆两种不同的错配结合蛋白MutS的基因，与纤维素结合域及绿色荧光蛋白融合表达，利用常规方法合成的寡核苷酸来验证MutS融合蛋白的功能，再建立优化的错配DNA结合条件及MutS组合，以去除芯片合成的有错寡核苷酸，并使用错误率大幅降低的寡核苷酸进行基因DNA合成。本项目预期建立一个简单快速的去除有错寡核苷酸和DNA片段的方法，为利用芯片合成的寡核苷酸低成本快速大规模高保真合成基因DNA打下基础。

随着生命科学的发展，我们逐渐在获取知识的“读”的同时，开始了对生物进行大规模的工程改造，也就是“写”，而写就需要通过DNA从头合成技术。传统的用于DNA从头合成的寡核苷酸过于昂贵，而芯片上原位合成寡核苷酸规模大、合成效率高，成为低成本DNA合成的原料。但是芯片合成的寡核苷酸有着错误率高、复杂度高等缺点。本研究建立了利用芯片合成的寡核苷酸为原材料进行基因长度DNA的合成方法，并通过高通量错误去除技术，大幅度提高了合成的DNA的保真性。首先成功地将错配结合蛋白MutS和纤维素结合域3进行了融合表达，对重组MutS的功能进行了验证，成功地采用固定化的错配结合蛋白MutS的纤维素柱子构建了高通量DNA合成中错误的去除方法，成功使合成的DNA错误率最高降低了25.84倍（低至0.58 个/kb），通量达到一个纠错反应479根不同寡核苷酸或者36根数百碱基的DNA片段， 材料成本低至$0.000063/ bp；高通量多引物寡核苷酸扩增方法最多可以将479根不同寡核苷酸在一个反应中扩增，并保证后续DNA组装成功；建立的“一锅组装法”可以将36个DNA片段在两次组装反应中组装，建立了多种基因长度DNA同时拼接方法，同时可拼接10个平均1kb的基因。并且，本研究构建的方法，在普通分子生物学实验室就可以完成。总之，本研究建立了一个大幅度提高以芯片寡核苷酸为材料合成的DNA的保真性的高效方法。最后，我们还成功地将建立的DNA合成技术应用在抗体的改造上，通过合成建立了一个高效的抗体文库，通过筛选获得一个亲和力提高了158倍的乳腺癌抗体。

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