小RNA重编程MSCs分化为胰岛素产生细胞治疗糖尿病的研究

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基本信息

  • 批准号：
    81370883
  • 项目类别：
    面上项目
  • 资助金额：
    61.0万
  • 负责人：
    庞希宁
  • 依托单位：
    中国医科大学
  • 学科分类：
    H0706.胰岛生理调控与功能异常
  • 结题年份：
    2017
  • 批准年份：
    2013
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2014-01-01 至2017-12-31

项目摘要

We have found that BMSCs can be reprogrammed to be insulin producing cells by knockdown of NRSF and Shh, or overexpression of Pdx1 and Ngn3; and the expression of miRNAs targeting Pdx1 and Ngn3 in mouse BMSC is higher than islet beta cell. Knockdown of NRSF, Shh and miRNAs targeting Pdx1, Ngn3 or Pax4 are proposed to reprogram BMSCs into mature islet beta cells, the histone modification and epigenetic regulation by miRNAs would be analysed. The BMSCs derived from ins-dsRED2/ngn3-eGFP transgenic mice would be transfected with siRNA above by linked to magnetic nanoparticles, and observed using living cell imaging system to evaluate their expression, to ascertain the best time of differentiation in real-time. Insulin and differentiation-related genes would be analysed by Real-time quantitative PCR, the expression and secretion of insulin would be detected by immunofluorescence and ELISA. The programming mechanisms would be explored by mRNA and miRNA sequencing, and histone modification test. Then the best programmed cells would be chosen to transplant into diabetic mice. BMSCs would be observed by MRI, and its relationship with blood glucose would be assessed. The aim of the study is to explore that siRNAs are transduced directly into islet cells to reprogramm them into islet beta cells.
我们发现抑制NRSF和Shh阻止神经分化或过表达胰岛前体细胞分化基因Pdx1和Ngn3使BMSC编程为产生胰岛素的胰岛前体细胞；小鼠BMSC比胰岛β细胞系高表达调控Pdx1和Ngn3 的miRNA。拟用小RNA干扰NRSF、Shh表达和调控Pdx1、Ngn3及β细胞成熟分化调控基因Pax4的miRNA，重编程MSCs为胰岛β细胞；研究其分化的组蛋白修饰和miRNA调控表观遗传学机制。通过磁纳米颗粒连结上述小RNA，导入Ngn3/胰岛素表达标签转基因小鼠BMSC，活细胞工作站观察它们的表达，实时评估分化的最佳时间。实时定量PCR鉴定胰岛素和胰岛分化基因的表达，免疫荧光和ELISA鉴定胰岛素表达和分泌。mRNA、miRNA测序和组蛋白修饰高通量检测研究编程机理，选择最佳编程细胞植入糖尿病小鼠， MRI和活细胞工作站观察BMSC，评估其与血糖和胰岛素的关系。为重编程BMSC为胰岛β细胞提供依据。

结项摘要

小RNA是一类重要的体内调节分子，包括miRNA、piRNA和siRNA等。可参与基因转录后水平调控，调节细胞生长、分化、凋亡等重要生物学过程。本研究拟通过小RNA干预促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）向胰岛素分泌细胞分化，为临床治疗糖尿病提供指导作用。.NR2F1是我们证明的新的小鼠胰岛素启动子区结合蛋白，在mBMSCs中高表达，而在胰岛β细胞系min6细胞中几乎不表达。通过siRNA转染，我们抑制了小鼠BMSCs中NR2F1的表达。该过程显著促进了mBMSCs向胰岛素分泌细胞的分化。经过30天的诱导分化，Real-time qPCR结果显示细胞高表达胰岛素分泌细胞标志物Pax6、Pdx1、Isl-1、Ins1、和Glut2；免疫荧光显示GFP阳性细胞中大量表达insulin和glut2；分化细胞双硫腙染色阳性。在高糖环境下，分化细胞的胰岛素和C肽分泌增强。将转染后的mBMSCs移植到STZ糖尿病小鼠模型体内，发现其能显著降低糖尿病模型小鼠血糖水平。.为了筛选调控胰岛β细胞分化的miRNAs，我们应用流式细胞分选首次成功分离提取出大量小鼠胰岛β细胞并与胰岛非β细胞、小鼠的骨髓及脂肪间充质干细胞进行小RNA二代测序并比较，获得了相对于其余3种细胞，小鼠胰岛β细胞中表达差异显著的miRNAs。我们选择了17个表达差异显著的miRNAs进行功能实验。结果显示，8条已知miRNAs及4条新miRNAs的转染能够促进mBMSCs分化为胰岛素分泌细胞。其中，miR-Da-5p及miR-Dc-5p组胰岛素升高明显，且细胞中胰岛素分泌细胞标志物的表达显著升高，诱导分化的细胞呈团块状生长，并显著表达胰岛素及Ngn3。MiR-375是间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞重要的调节因子。我们分别将miR-Da-5p及miR-Dc-5p mimics与miR-375 mimics共转染后，发现共同转染两种模拟物后细胞胰岛素及胰岛β细胞相关标志物的表达水平较前有显著升高。将转染后的mBMSCs移植到STZ糖尿病小鼠模型体内，发现其能显著降低糖尿病模型小鼠血糖水平。为了探讨miR-Da-5p及miR-Dc-5p促进小鼠骨髓间充质干细胞重编程为胰岛β细胞的机理，我们进一步通过实验证明了miR-Da-5p与miR-Dc-5p通过抑制Mtpn及Notch1促进mBMSCs分化为胰岛素分泌细胞。

项目成果

期刊论文数量（8）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
miR-136 modulates TGF-β1-induced proliferation arrest by targeting PPP2R2A in keratinocytes.
miR-136 通过靶向角质形成细胞中的 PPP2R2A 调节 TGF-β1 诱导的增殖抑制
  • DOI：
    10.1155/2015/453518
  • 发表时间：
    2015
  • 期刊：
    BioMed research international
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    Zhang D;Wang J;Wang Z;Zhang T;Shi P;Wang X;Zhao F;Liu X;Lin X;Pang X
  • 通讯作者：
    Pang X
Repression of COUP-TFI Improves Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell Differentiation into Insulin-Producing Cells.
COUP-TFI 的抑制促进骨髓间充质干细胞分化为胰岛素产生细胞
  • DOI：
    10.1016/j.omtn.2017.06.016
  • 发表时间：
    2017-09-15
  • 期刊：
    Molecular therapy. Nucleic acids
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    Zhang T;Li XH;Zhang DB;Liu XY;Zhao F;Lin XW;Wang R;Lang HX;Pang XN
  • 通讯作者：
    Pang XN
Dynamic Expression of Novel MiRNA Candidates and MiRNA-34 Family Members in Early- to Mid-Gestational Fetal Keratinocytes Contributes to Scarless Wound Healing by Targeting the TGF-β Pathway.
新型 miRNA 候选物和 miRNA-34 家族成员在妊娠早期至中期胎儿角质形成细胞中的动态表达通过靶向 TGF-β 途径促进无疤痕伤口愈合
  • DOI：
    10.1371/journal.pone.0126087
  • 发表时间：
    2015
  • 期刊：
    PloS one
  • 影响因子：
    3.7
  • 作者：
    Zhao F;Wang Z;Lang H;Liu X;Zhang D;Wang X;Zhang T;Wang R;Shi P;Pang X
  • 通讯作者：
    Pang X
In Vitro Toxicity of PEI-Coated Fe3O4 Nanoparticles in HaCaT Cells
PEI 包覆的 Fe3O4 纳米颗粒对 HaCaT 细胞的体外毒性
  • DOI：
    10.1166/mat.2014.1152
  • 发表时间：
    2014-04-01
  • 期刊：
    MATERIALS FOCUS
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    Zhang, Dianbao;Wang, Rui;Pang, Xining
  • 通讯作者：
    Pang, Xining
负向调节因子重编程诱导大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛内分泌细胞分化的研究
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2015
  • 期刊：
    中国医科大学学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    李宏图;林学文;李彩虹;庞希宁
  • 通讯作者：
    庞希宁

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其他文献

人羊膜间充质干细胞来源外泌体的提取与鉴定
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2020
  • 期刊：
    解剖科学进展
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    陈萌;赵峰;李莹;张焜;张涛;王瑞;庞希宁
  • 通讯作者：
    庞希宁

其他文献

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庞希宁的其他基金

大鼠骨髓MSCs重编程分化为胰岛β细胞机理的研究
  • 批准号：
    81150018
  • 批准年份：
    2011
  • 资助金额：
    10.0 万元
  • 项目类别：
    专项基金项目

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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