中国汉族人原发性远端肾小管酸中毒V型H+-ATP酶B1亚基与a4亚基基因突变及相关功能研究

本研究建立了了国内外最大组原发性dRTA的临床资料库，对其中66例患者包括12个dRTA家系，散发患者46例进行了dRTA的致病基因ATP6V0A4、ATP6V1B1及SLC4A1进行了筛查。发现了ATP6V0A4基因的SNP5个，单纯杂合变异2个(M580T、A630I)，ATP6V1B1基因的SNP9个，发现三个已知SLC4A1突变(R589C, R589H, G609R），突变发现率明显低于文献报道。在功能研究方面，构建成功含有R449H、P524L、M580T突变的ATP6V0A4-pEGFP-N1质粒及R589C突变的SLC4A1-pIRES2-EGFP Vector质粒，并将其表达在HEK293t细胞，野生型ATP6V0A4融合蛋白与三种突变型ATP6V0A4融合蛋白均可以与内质网标志物calnexin共定位，野生型ATP6V0A4融合蛋白与R449H、M580T ATP6V0A4融合蛋白可以与高尔基体标志物GM130共定位，而P524L ATP6V0A4融合蛋白不能与GM130共定位。野生型ATP6V0A4免疫沉淀产物可以与E亚基结合，但是突变型ATP6V0A4免疫沉淀产物均不能与E亚基相结合。野生型AE1蛋白和R589C突变型与内质网的标志物Calnexin 以及高尔基体标志物GM130均有共定位（图6）。对野生型以及突变型AE1蛋白在细胞内的表达用WESTERNBLOT分别检测总蛋白以及膜蛋白中的表达情况，我们发现在总蛋白中表达无明显差异，而在膜蛋白中表达明显减少。结果证实这些突变为失功能性突变。