无抗性标记纤维素酶基因重组乳酸杆菌表达系统的构建

为缓解饲料原料的紧张提高粗饲料利用率，保证饲用纤维素酶活性，本项目拟采用分子生物学和基因工程的方法，以纤维素酶基因和绿色荧光蛋白基因为外源基因，构建穿梭表达载体，通过双交叉整合重组到鸡消化道优势乳酸菌宿主中；构建乳酸杆菌纤维素酶基因重组菌，使外源纤维素酶基因能够在宿主菌中表达；以cre-LoxP系统作为辅助载体删除重组菌的抗生素抗性基因构建无抗性标记重组菌。将重组菌接种到动物消化道，荧光下计数观察定植与分布情况；实时定量方法检查基因的表达；同时测定动物生产性能，饲料粗纤维的消化率，免疫性能的变化。通过上述方法，拟获得的结果为：构建高效表达载体，成功表达外源纤维素酶基因；通过电击整合构建无抗性标记乳酸杆菌纤维素酶基因重组菌；对重组菌理化性质进行研究；工程菌能够定植到动物消化道并表达分泌纤维素酶和绿色荧光蛋白，得出对动物生产性能、粗纤维消化率和免疫性能的影响；确定其在消化道的比例和分布。

纤维素是动物日粮中主要的抗营养因子之一，严重阻碍营养素的消化和吸收，同时由于动物分泌纤维素酶不足（反刍动物）或缺乏（如猪和家禽），大量营养素被排泄到体外，造成了对环境的污染。乳酸菌是动物肠道的优势菌群，具有很强的耐胆盐、胃酸和抑菌活性，及定植和粘附能力。由于其独具的益生特性和生理功能，已被广泛地用于饲料添加剂。本项目将外源纤维素酶基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因克隆到来源于鸡肠道的乳酸杆菌中，获得具有益生特性和纤维降解能力的重组乳酸杆菌和GFP重组乳酸杆菌，并验证其肉鸡饲喂效果。建立了以雏鸡为模型动物，从基因克隆、无抗标记整合载体构建、宿主菌的筛选与重组到消化道的定植与表达这样一个完整的技术体系。主要研究结果如下：(1)克隆的纤维素酶基因中，cel15基因在大肠杆菌中实现功能性表达，胞内上清和沉淀中内切葡聚糖酶活性分别达到1.18±0.07和0.44±0.05 U.ml-1，为其在乳酸杆菌中的表达奠定了基础；(2)从成年鸡的胃肠道分离得到15株乳酸杆菌，并解析了它们在成年鸡胃肠道的数量和分布情况，确定了罗伊乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri XNY）等6株菌在鸡胃肠道的分布丰度较高；建立了这6株乳酸杆菌的最佳转化条件（其中最高转化效率达32.6 ±7.2×107 个转化子/μg DNA）。获得重组乳酸杆菌的理想宿主菌；(3)构建了重组纤维素酶和GFP整合载体，并分别转化整合至Lactobacillus reuteri XNY基因组中，获得一株无抗性标记的纤维素酶重组乳酸杆菌和GFP重组乳酸杆菌，均成功实现表达。其中纤维素酶活力为0.89U/mL；(4)动物饲养试验结果表明：接种重组乳酸杆菌对雏鸡的体增重有显著影响(P＜0.05)，对饲料粗纤维的消化率差异也较显著(P＜0.05)。同时，乳酸杆菌能够显著地提高肉仔鸡免疫器官指数(P＜0.05)，增加血清葡萄糖和免疫蛋白的含量，从而改善机体的免疫力；重组乳酸杆菌在体外能够黏附于小肠上皮细胞上，表明重组乳酸杆菌能够在雏鸡的消化道定植和表达。.通过本项目的实施，获得了优良的纤维素酶基因资源，筛选鉴定得到了益生性好、适于遗传操作的乳酸菌资源；构建了无抗性标记的纤维素酶重组乳酸杆菌，并在肉鸡饲养试验中显著提高了动物生产性能和免疫机能；培养博士研究生4名，硕士研究生5名，参加国内学术交流2次，发表学术论文8篇。

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