结合靶向表面增强拉曼光谱进行牛蒡子苷元舒张气道平滑肌机制研究

Scientific evidences reveal airway smooth muscles (ASM) as effectors of airway obstructive diseases (AOD), such as asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). It’s one of the key elements to discover ingredients with ASM relaxation effect and the underlying mechanisms in fields of traditional Chinese medicine (TCM). Excitation-contraction coupling with calcium regulation and cellular membrane stabilization can affect hyperresponsiveness and spasm of airways. Our previous studies showed that: arctigenin exhibited relaxation effect on tracheae to different constrictors, and this was related to decreasing cytoplasmic Ca2+ concentration by inhibiting Ca2+ influx partly through L-type calcium channel as well as promoting Ca2+ efflux. However, the detailed molecular mechanism remains elusive. In light of TCM theory as well as modern pharmacology, this project aims at how arctigenin regulating calcium concentration and cellular membrane stabilization. Rat asthma model in vivo and primary ASM cells in vitro shall be established, with adoption of SERS raman spectrum instrument, patch clamp, laser confocal, Western Blot, qRT to explore the potential mechanism how arctigenin relax airway smooth muscles. What’s more, Raman spectroscopy based platform will further contribute to action mechanism research of drugs especially in subcellular levels.

研究认为气道阻塞性疾病发病过程中的主要效应器为气道平滑肌（ASM），钙离子调节ASM舒缩、ASM细胞膜稳定性影响气道高反应性及气道痉挛。探索具有ASM舒张作用的中药单体的分子靶点及作用机制是中医药现代化与呼吸系统药理相结合的重要研究内容之一。课题组前期研究显示：牛蒡子苷元缓解多种收缩剂所致气管条收缩、降低ASM细胞膜钙离子通道电流、促进钙离子排出和抑制钙离子进入细胞，均提示牛蒡子苷元可能通过降低胞内钙离子浓度和稳定细胞膜而舒张ASM。本项目旨在中医药理论及现代药理学思想指导下，建立豚鼠和大鼠哮喘模型和原代大鼠ASM细胞模型及豚鼠离体气管条张力测定模型，以调节ASM胞内钙离子浓度和稳定细胞膜为切入点，结合SERS拉曼光谱、膜片钳、激光共聚焦等现代先进技术，研究牛蒡子苷元舒张气道平滑肌机制；特别是基于拉曼光谱的药物作用机制研究方法学的建立，将有助于确定药物单体亚细胞水平定位。

牛蒡子是中国传统中药，牛蒡子苷是主要药理成分。牛蒡子苷元是牛蒡子苷通过人类肠道细菌催化代谢的产物。本研究首先测定了牛蒡子苷和牛蒡子的表面增强拉曼光谱，而后基于体外重组UGT催化4-甲基伞形酮（4-MU）葡萄糖醛酸化反应进行了牛蒡子苷及牛蒡子苷元对重要药物代谢酶UGTs的抑制研究。高效液相色谱法（HPLC）用于分离4-MU和葡萄糖醛酸化产物。使用基于体外数据的体内数据预测（IV-IVE）的方法来预测体内抑制的情况。实验表明，100uM的牛蒡子苷及牛蒡子苷元强烈抑制UGT1A3、1A9、2B7、2B15的活性。抑制动力学研究结果表明牛蒡子苷竞争性抑制UGT2B15，牛蒡子苷元非竞争性抑制UGT2B15，牛蒡子苷比牛蒡子苷元会诱导更强的药物-药物相互作用。后续又进行了牛蒡子苷元系列衍生物的全合成以及衍生物对UGT酶的抑制研究，共获得6个合成的衍生物，体外筛选实验表明，100uM的牛蒡子苷元衍生物强烈抑制UGT1A3、1A7、2B4、2B7的活性。抑制动力学研究结果表明牛蒡子苷元衍生物1竞争性抑制UGT1A3，牛蒡子苷元衍生物4非竞争性抑制UGT2B7。牛蒡子苷元衍生物1和4对UGT1A3及UGT2B7的ki值分别被计算为0.067和4.446。基于抑制评价标准([I] /Ki < 0.1，低可能性;0.1 < [I] /Ki < 1，中等的可能性;[I] /Ki > 1，可能性高)，牛蒡子苷元衍生物1会诱导更强的药物-药物相互作用。牛蒡子苷及牛蒡子苷元对重要的UGT亚型的抑制作用在当今研究中有价值，对探索牛蒡子苷及牛蒡子苷元与临床药物之间的相互作用提供了有用的信息。有必要注意使用含牛蒡子苷和牛蒡子苷元的药物可能影响其他药物的排泄而引起有临床意义的药物相互作用，为今后临床药物相互作用研究提供参考。另外，通过中医传承辅助系统进行溃疡性结肠炎和痔疮方剂经典名方和新方挖掘, 筛选出溃疡性结肠炎257个处方进行分析，挖掘6个核心组合和3首新方。完成对痔疮组方数据库提供的295个方剂进行分析，获得3首新方剂。从宏观和微观角度对溃疡性结肠炎和痔疮的中药治疗挖掘新方并研究潜在分子机制，为研究中医方剂推演提供方向指导，对于研究经典名方及中药二次开发有积极意义。

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