双功能温敏微球的制备及在蛋白质组学中的应用研究

本研究拟引入温敏型聚N-异丙基丙稀酰胺（PNIPAM）作为蛋白质组酶解过程中胰蛋白酶固定化微球，装于微柱中，既可提高酶浓度，又可通过调节温度改变微球的亲疏水性提高底物浓度，为实现酶解过程绿色环保、在线、快速提供新方法。尝试采用膜乳化法合成尺寸均一、表面带有氨基的PNIPAM温敏微球，探索适合尺寸均一、粒径可控温敏型聚合物制备的新工艺；将合成的温敏微球与胰蛋白酶在戊二醛存在下交联，考察酶浓度、戊二醛用量、反应时间等因素对酶固定化反应的影响；以标准蛋白BSA稀溶液（浓度低于pmol级）为研究对象，考察不同酶固载量的微球酶解效率和速率，并根据肽段检出率和质谱信噪比等指标确定最佳酶固载量；综合固定化酶、微球的蛋白吸附和柱内酶解等区别于自由酶解的特性建立适合温敏载体固定化酶柱内酶解的模型；根据复杂生物样品质谱分析结果特别是低丰度蛋白检出数目来评价、改进和修正介质制备工艺和模型参数。