绒山羊精原干细胞的分离、长期培养及体外分化成精子的机制探索

The continuation of the spermatogenic process throughout life relies on a proper regulation of self-renewal and differentiation of the spermatogonial stem cells ( SSCs ). These cells are only unique stem cells in adult body that can transmit genetic information to the next generation. Right now, vitro research on SSCs mainly focuses on rodents. There is a few related report on goats. However, the method for long-term culture of livestock SSCs has not yet been established so far. The molecular mechanism of the goat SSCs differentiation is not well known. .Our revious studies have isolation、purification and preliminary long-term cultured Cashmere goat SSCs. In here, the subject attempts to establish a long-term culture system of Cashmere goat SSCs in vitro. Differentiation into hapoloid sperm on Sertoli cells feeder layer. To analysis the fertilization ability of differentiated cells, the sperms are microinjected into the zona pellucida of metaphase II-stage oocytes. Attempts to discover the molecular mechanisms for sperm generation, transcriptomes of SSCs, spermatocytes and round spermatids are analyzed using gene chips. Cashmere goat is an important economic animal. Studies on in vitro differentiation of Cashmere goat SSCs and transcriptome during the mitotic phase of spermatogenesis, could understand the molecular mechanisms for sperm generation and innovative transgenetics.

成年哺乳动物的精子发生过程依赖于精原干细胞不断地自我更新和分化，并持续一生。精原干细胞是雄性动物体内唯一可复制并能将基因传递至子代的成体干细胞。目前精原干细胞的研究主要集中在啮齿动物，山羊的相关研究报道较少。至今山羊精原干细胞的长期培养方法还没有完善，对其分化的分子机制还知之甚少。本研究在前期初步建立绒山羊精原干细胞分离、长期培养系统的基础上，拟进一步优化绒山羊精原干细胞的长期培养方法。并以睾丸Sertoli细胞为饲养层，诱导长期培养的绒山羊精原干细胞分化为单倍体精子。通过显微注射技术，将体外分化的精子注射到卵母细胞，检测其授精能力。与此同时，分析精原干细胞、精母细胞和圆形精子细胞的转录组，对绒山羊精原干细胞分化的分子机制进行探索。绒山羊是一种重要的经济家畜。精原干细胞体外分化及分化过程中的转录组研究有助于解读绒山羊精子发生的分子机制，并对利用其进行遗传传修饰生产转基因动物具有重要意义。

精原干细胞位于睾丸曲细精管生精上皮的基底膜上，是雄性动物体内唯一可复制并能将基因传递至子代的成体干细胞。成年年哺乳动物的精子发生过程依赖于精原干细胞不断地自我更新和分化，并持续一生。目前精原干细胞的研究主要集中在啮齿动物，山羊的相关研究报道较少。建立山羊精原干细胞的长期培养方法，并解读其分化自我更新和分化调控的分子机制具有重要的意义。本研究利用三步酶消化法和差异贴壁法分离纯化绒山羊SSCs。以丝裂霉素处理的STO细胞做滋养层，建立SSCs长期培养系统。该细胞可在体外形成SSCs簇，并且可以连续培养30代，表达SSCs特异的CDH1、GFRα、PLZF。同时利用两步酶消化法和差异贴壁法纯化建立Sertoli细胞系，该细胞系特异性表达生长因子GDNF， SCF和 β1-integrin。分别利用Sertoli细胞、STO细胞饲养层体外诱导SSCs分化成初级精母细胞细胞并表达 SCP3，为日后研究精子发生机制奠定了基础。为了进一步探索调控绒山羊精子发生的分子机制，本研究分别提取青春前期86、102、110日龄的绒山羊睾丸总RNA，进行了转录组测序，分析比较这一节点中基因表达模式变化。结果显示，在86、102、110日龄的绒山羊睾丸种存在2672个共同差异表达基因，其中86日龄与102日龄绒山羊睾丸中共有7718个差异表达基因，包括上调3989个，下调3729个；而110日龄与 102日龄差异表达基因8716个，包括4173个上调基因和34543个下调基因。86与110日龄绒山羊睾丸中差异基因总数为9940个，其中上调的基因4832个，下调的基因5108个。利用qRT-PCR和Western blot技术阐明青春前期56-122日龄绒山羊睾丸中SSCs自我更新相关基因fgfr1、fgf2、wnt5a、plzf、dmrt1、taf4b、scf以及减数分裂相关基因sycp2、boll、brdt、smc1b、dmc1、hspa2、meiob的表达模式。绒山羊至少从56日龄起即开始第一轮减数分裂产生初级精母细胞，102日龄开始DNA双链断裂重组修复，但存在个体差异。确认精子发生相关KLHDC3与MEA1蛋白之间存在相互作用。以上研究有对解读其精子发生调控的分子机制，优良家畜种质资源的保存、及品种改良等方面都有着重要的意义。

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