南极假丝酵母脂肪酶B展示过程中“锚定”与“分泌”两种类型共存的机制及调控

结题报告
项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    30900017
  • 项目类别：
    青年科学基金项目
  • 资助金额：
    21.0万
  • 负责人：
    韩双艳
  • 依托单位：
    华南理工大学
  • 学科分类：
    C0103.微生物组学与代谢
  • 结题年份：
    2012
  • 批准年份：
    2009
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2010-01-01 至2012-12-31

项目摘要

南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）利用絮凝素Flo1p的N端絮凝功能结构域（FFD）在毕赤酵母表面展示时，同时存在aCALB(锚定在细胞壁壁)与sCALB（分泌到发酵液中）两种形式。sCALB可能是外源CALB完成展示的"过渡态"。本项目利用基于FFD的表面展示系统实现CALB在毕赤酵母细胞表面的活性展示，通过研究aCALB与sCALB糖基化程度、是否单体聚合，解释"锚定"与"分泌"的分子量或结构差异；同位素示踪、诱导过程跟踪和甘露糖抑制实验，研究aCALB与sCALB蛋白积累和酶活变化规律以及单个酵母细胞表面酶展示量的变化阐明sCALB可能是外源CALB完成展示的"过渡态"。进一步通过控制C源、温度、比生产速率等参数，研究aCALB与sCALB两种蛋白的调控机制。本研究为外源脂肪酶在酵母细胞表面实现展示的动态过程以及展示机制的阐明奠定理论基础，也对实现脂肪酶在酵母细胞的高效展示有指导意义。

结项摘要

外源脂肪酶展示在酵母细胞表面，表现出耐温、耐有机溶媒、回收方便/可重复使用等优良特性，正成为继固定化酶之后新的酶制剂形式。但单位酵母细胞表面展示酶催化效率较固定化酶低是制约其发展的重要瓶颈。了解脂肪酶在酵母细胞表面的展示剂量、调控机制对丰富酵母展示理论和指导改善酵母细胞表面展示效率有重要意义。. 酿酒酵母絮凝素Flo1作为锚定蛋白，其N 端絮凝功能区(flocculation functional domain，FFD)能识别并且以非共价键连接到细胞壁的甘露聚糖复合物上，外源蛋白以C 端游离的形式展示在酵母细胞表面，称为FFD锚定系统。本课题首先完善和建立了一套毕赤酵母的细胞壁蛋白的分类、提取方法，采用hot-SDS法可有效提取基于FFD系统锚定在酵母细胞壁上的脂肪酶。接着实现了毕赤酵母细胞表面展示的酶蛋白分子数的直接定量。利用增强型绿色荧光蛋白EGFP作为标记蛋白，发现FFD系统展示南极假丝酵母脂肪酶B （CALB）时，两种重组菌发酵上清中均存在相同程度的“泄露”，且泄漏到上清中的蛋白与锚定在酵母胞壁上的展示蛋白结构一致。将上清中蛋白量与相对荧光强度的对应规律类比到酵母细胞壁锚定蛋白，建立了酵母细胞壁锚定蛋白相对荧光强度与细胞表面蛋白载量的对应关系。首次直接验证了在毕赤酵母细胞壁上利用FFD系统锚定的蛋白为16000个/细胞。. CALB利用FFD在毕赤酵母表面展示时，部分CALB活性的蛋白泄露到重组酵母发酵上清中，称为分泌型（secreted CALB）。脱落到细胞上清中的sCALB有两种形式：一种为大分子融合CALB（big secreted CALB, bs CALB），经质谱鉴定为絮凝素与CALB的融合蛋白，分子量216kD，等电点3.97，与固定在细胞壁上的aCALB实为同一种分子。另一种为小分子CALB（small CALB，ssCALB）,该分子为约37kD，与游离CALB分子量相当。bsCALB与ssCALB对发酵液酶活贡献为3:1。aCALB,ssCALB，bsCALB 都存在N和O 糖基化，且bsCALB 和aCALB的糖基化程度接近。但糖基化不是造成展示过程中脂肪酶泄漏到上清的主要原因。 改变重组酵母的碳、氮源、氨基酸添加量以及温度等培养条件，可轻微改变aCALB与sCALB的量和比例。

项目成果

期刊论文数量（4）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
重组毕赤酵母细胞壁蛋白的抽提和分析
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    --
  • 期刊：
    华南理工大学学报(自然科学版)
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    林影;周新莹;韩双艳;张莉;叶燕锐;郑穗平;Lin Ying Zhou Xin-ying Han Shuang-yan Zhang Li Ye
  • 通讯作者：
    Lin Ying Zhou Xin-ying Han Shuang-yan Zhang Li Ye
Quantitative evaluation of Candia antarctica lipase B displayed on the cell surface of a Pichia pastoris based on an FS anchor system
基于 FS 锚定系统对毕赤酵母细胞表面显示的南极假丝酵母脂肪酶 B 进行定量评估
  • DOI：
    10.1007/s10529-012-1085-2
  • 发表时间：
    2013-03-01
  • 期刊：
    BIOTECHNOLOGY LETTERS
  • 影响因子：
    2.7
  • 作者：
    Liang, Xing-xiang;Wang, Bei-bei;Cui, Tang-bing
  • 通讯作者：
    Cui, Tang-bing
Double Candida antarctica lipase B co-display on Pichia pastoris cell surface based on a self-processing foot-and-mouth disease virus 2A peptide
基于自加工口蹄疫病毒 2A 肽，双南极念珠菌脂肪酶 B 在毕赤酵母细胞表面共展示
  • DOI：
    10.1007/s00253-012-4264-0
  • 发表时间：
    2012-07
  • 期刊：
    Applied Microbiology and Biotechnology
  • 影响因子：
    5
  • 作者：
    Sun, Yu-Fei;Lin, Ying;Zhang, Jun-Hui;Zheng, Sui-Ping;Ye, Yan-Rui;Liang, Xing-Xiang;Han, Shuang-Yan
  • 通讯作者：
    Han, Shuang-Yan

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其他文献

棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶Ⅰ在毕赤酵母中的表达及烷基糖苷的催化合成
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2012
  • 期刊：
    Chemical Journal of Chinese Universities
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    刘端玉;韩双艳;林影;郑穗平
  • 通讯作者：
    郑穗平
酶高效表达体系构建及高通量筛选关键技术
  • DOI：
    10.3969/j.issn.1674-0319.2019.03.005
  • 发表时间：
    2019
  • 期刊：
    生物产业技术
  • 影响因子：
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  • 作者：
    林影;韩双艳;袁清焱;李承
  • 通讯作者：
    李承

其他文献

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韩双艳的其他基金

酵母细胞壁多糖合成途径挖掘及其关键基因的表达调控机制
  • 批准号：
    31771958
  • 批准年份：
    2017
  • 资助金额：
    60.0 万元
  • 项目类别：
    面上项目

相似国自然基金

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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