基于骨软骨界层结构在体重建成骨和成软骨微环境诱导BMSCs定向分化实验研究

透明软骨与软骨下骨微环境差异显著，其间的界层结构一旦发生损伤，将导致骨髓腔与关节腔相通，骨与软骨微环境发生紊乱。鉴于微环境稳定是保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的重要条件，在前期研究界层结构的基础上，我们提出“利用界层结构为植入的骨髓间充质干细胞（BMSCs）重建成骨和成软骨微环境，实现其定向分化再生修复骨软骨缺损”新理念。本项目研究重点在于阐明体重建微环境的可行性和必要性，探讨不同微环境对BMSCs增殖、分化及转归的可能影响机制。项目获得批准后，项目负责人积极组织项目组成员进行开题论证，并按照计划书内容进行分工。截止2013年12月份，已经按计划完成任务书所有研究内容，取得研究成果包括：建立贵州小香猪BMSCs分离、培养及鉴定方法，抽取20ml骨髓体外培养1周即可获得2×108个BMSCs，纯度达95%以上。制备出含天然“界层结构”骨软骨仿生支架，支架为圆柱状，直径8mm，软骨层厚2mm，软骨下骨厚5mm；软骨层孔隙率为91.1±3.8%，孔径为79.7±17.1µm；软骨下骨孔隙率为73.5±2.6%，孔径为470.2±158.8µm；界层结构无孔隙。将BMSCs以适宜密度接种于支架后进行体内植入，术后24周证实有界层结构组骨软骨缺损修复完整，修复组织的形态结构和组织成分与正常骨软骨相似；无界层结构组软骨区的修复组织主要为纤维软骨，软骨下骨修复完整；空白对照组基本未修复。O’Driscoll组织学评分：空白对照组5.5±0.52；无界层结构组14.2±0.68；有界层结构组18.8±0.87。BMSCs在体生物学行为研究结果表明修复组织的细胞均可被GFP和Brdu免疫组化染呈绿色荧光和红色荧光，证实细胞来源于体外植入，在体内增殖并分化形成软骨细胞。微环境分析结果表明正常关节液氧分压为7.5±0.36mmHg，骨髓液氧分压为50.6±1.23 mmHg，两者差异显著（P<0.01）。术后12周和24周各组关节液和骨髓液的氧分压均无显著变化。正常关节腔压力为-12±2.2 mmH2O，骨髓腔压力为14±1.5 mmH2O，术后12周，各组关节腔压力均有不同程度增高，空白对照组关节腔压力增高最明显为-5±1.9 mmH2O，有界层结构组增高最低约为-10±1.5 mmH2O；各组髓腔压力均显著高于正常组（P<0.01），但组间无差异。术后24周，有界层结构组关节