先天性脊柱侧凸合并先天性心脏畸形队列的遗传及机制研究

About 14-27% of patients with congenital scoliosis (CS) are also affected with congenital heart disease (CHD), which significantly impact the treatment strategy of those patients. Some nomogenic syndromes including Alagille syndrome and VACTER syndrome can manifest both CS and CHD. The spine and the heart both originate from mesoderm, and are regulated by common pathways such as Notch, FGF and Wnt. Therefore, identification of genetic variants in theses pawthways is important in finding the etiology of CS+CHD..In our prepliminary studies, we have accomplished exome seuqnecing of 100 CS+CHD patients, 600 CS patients without CHD, and 2000 patients without relevant malformations. We hypothize that ‘genetic variants in common pathways of skeletal development and heart development contribute to the etiology of CS+CHD. Based on this hypothesis, we plan to test the mutational burden of genes required for skeletal and heart development in CS+CHD patients and prioritize candidate variants. Then we plan to validate the pathogenicity of the candidate variants in vivo and in vitro. After validation of disease genes, we will explore the molecular mechamism of these genes, which will provide evidenc for gene conseling and precision therapy for CS+CHD condition.

先天性脊柱侧弯（CS）患者伴发先天性心脏异常（CHD）的比例为14-27%，对于患者的治疗选择有重要影响。一些已知的单基因遗传综合征如Alagille综合征的表型谱中包括了CS和CHD。脊柱和心脏在发育过程中共用的多条信号通路，如Notch通路和FGF通路等。因此，对这些共有的信号通路的基因突变的分析对我们揭示CS+CHD病因和发病机制有重要意义。申请者所在课题组前期完成了100例CS合并CHD，600例CS无CHD，以及2000例无相关畸形对照样本的全外显子测序，提出“影响骨骼发育和心脏发育共同通路的基因突变导致CS+CHD的发生”这一假说。本研究将以此假说为基础，首先建立同时影响骨骼发育和心脏发育的候选基因库；进而利用病例-对照研究进行候选基因库的突变负荷研究，鉴定导致CS合并CHD的新致病基因，并利用斑马鱼/细胞模型进行验证；最终在体内和体外探究新致病基因的分子机制。

本研究首先建立同时影响骨骼发育和心脏发育的候选基因库并在CS队列中进行突变负荷分析，找到了6个既往报道的致病基因，我们对6个既往报道的致病基因进行初步分析，找到MYO18B基因的3个罕见突变，其中两个突变的携带者都患有先天性心脏病。在对所有候选基因进行突变负荷分析后，我们发现BAZ1B显著性最高，其次是FREM2、SUFU、VANGL1和KMT2D；此外我们还发现多个患者携带有这5个基因中的多个基因突变。这一研究不仅确认了5个可能和CS相关的新基因，同时为CS潜在的多基因致病模型提供了证据。结合负荷分析筛选出的高致病性基因，我们通过使用CRISPR-CAS9 技术对候选基因的斑马鱼同源基因进行敲除，发现候选基因可以同时导致斑马鱼出现脊柱侧弯及先天性心脏病相关的表型。同时，我们在数据分析时发现了CSF1R和FGFR1基因的高致病性突变，分别进行斑马鱼体内过表达实验与体外细胞功能验证实验。发现了三个CSF1R基因的有害突变。在斑马鱼中构建CSF1R有害突变过表达模型，观察到子代斑马鱼出现半椎体以及椎体融合等骨骼畸形，揭示了CSF1R突变的致病性，并拓展了CSF1R突变的致病模式。我们在CS+CHD队列中发现了一个FGFR1移码突变，并在CS队列中发现了多个FGFR1错义突变，对比公共突变数据库发现这些突变均为新生或频率极低的突变，且在不同的物种中高度保守，说明这些突变位点可能具有潜在致病性。通过构建FGFR1定点突变质粒并导入大鼠成肌细胞L6以及COS-7细胞系中，发现这些突变均导致下游细胞信号转导功能显著下降；并且这些突变均导致蛋白表达水平显著下降。同时，多种算法对突变功能预测的结果显示，这些位点的突变可能使蛋白质产物功能降低或丧失，从而导致疾病发生，被认为具有较强的致病性。上述结果在一定程度上证明了FGFR1的功能缺失突变在CS与CHD患者中的致病作用，同时信号转导与表达量分析为进一步在表达水平上研究蛋白质上下游互作提供有价值的研究方向，有助于挖掘其他基因在CS与CHD疾病致病中的作用或共同致病模式，为后续深入探究基因的致病机制奠定了重要的理论基础。

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