动脉粥样硬化差异性表达miRNAs的二次筛选、效应验证和作用机制

近年研究提示miRNAs在细胞增殖、凋亡、脂质代谢等过程中发挥重要作用，而动脉粥样硬化是由多种因素驱动而与上述过程密切相关的慢性炎症免疫过程。.一、检测miRNAs差异性表达。.（1）采集动脉粥样硬化/急性心梗/正常对照人群外周血标本，采用miRNA microarray芯片高通量筛选差异性表达的miRNAs。.（2）在三个人群（急性心肌梗死、心绞痛、对照），实时定量PCR检测，同时检测cTnI。与对照相比，在急性心梗，miR-133a与cTnI变化趋势相同，在冠心病患者也升高。外周血表达水平与急性心梗的严重程度密切相关，且在急性心梗发病的早期（<4h）其对急性心梗的诊断特异性和敏感性高于传统金标准—肌钙蛋白。.（3）在脑梗塞对照的血液，实时定量PCR检测。与对照相比，直至24周，miR-30a和miR-126显著下调，ROC曲线分析miR-30a, miR-126和let-7b可作为缺血性卒中的生物标志物。.二、查阅文献、分析芯片数据，结合生物信息学预测，初步筛选下一步研究的miRNAs。.（1）挑选在患者与正常人群中表达差异最显著，且表达量与疾病严重程度呈正相关的microRNA-miR-320a进行功能研究， miR-320a能显著抑制内皮细胞的增殖，并促进内皮细胞凋亡，而anti-miR-320a则具有相反的作用，提示miR-320a极有可能参与了内皮功能介导的动脉粥样硬化病理生理进程的调控，是新的治疗靶点。.（2）通过生物信息学分析和初步生物学验证，我们还发现miR-320a极有可能通过重要的转录因子（血清反应因子, SRF）介导脂质代谢调节和抗氧化应激的作用。.（3）采用三质粒磷转染法，分别包装 miR-320a 的表达载体（rAAV-miR-320a），miR-320a 的错义突变表达载体（rAAV-miR-320a-mut）、miR-320a 的表达沉默载体（rAAV-anti-miR-320a）和对照载体（rAAV-GFP）。 ② ApoE-/-小鼠予以高脂饮食（12 周）的动脉粥样硬化模型，分别从尾静脉注射各组载体，检测其对心功能和动脉粥样硬化的影响。.我们的结果发现miR-320a具有促进动脉粥样硬化的作用，利用anti-miR-320a治疗具有逆转动脉粥样硬化的效果。