射干异黄酮类化合物生物合成途径下游通路关键酶基因的克隆、表达和功能研究

To understand molecular mechanisms of the quality forming process of Belamcandae rhizoma that is a common used Chinese materia medica, the methods of molecular biology, plant metabolomics, bioinformatics and biotechnology are used to study the biosynthesis pathway and molecular regulation mechanisms of isoflavonoids that is the main active components of Belamcanda chinensis. Using exogenous biological and non-biological elicitors induce and strengthen the biosynthesis pathway of isoflavonoids in the cell, callus and aseptic seedlings. The correlation between the genes expression of the key enzymes in the biosynthesis pathway and accumulation of isoflavonoids will be found by using differential transcriptome and metabolomic analysis, and the best elicitor be selected. We will discover the key enzymes genes in the downstream biosynthesis pathway of isoflavonoids in Belamcanda chinensis, and clone the key enzymes genes such as isoflavone synthase (IFS), flavone-6-hydroxylase (F6H), glycosyl transferase (GTs) and isoflavone O-methyltransferases (IOMTs) genes, and then study their expression, function validation and regulation. It could clarify isoflavonoid biosynthesis pathway in Belamcanda chinensis, and explain the biological nature for quality formation of Belamcandae rhizoma. It provides a scientific basis for further improving the quality of Belamcanda cinensis, breeding, standardized cultivation and quality control, which has important theoretical significance and practical value.

射干为治疗咽喉肿痛的要药，富含的异黄酮是其活性成分和质控指标。针对其质量形成过程分子机制尚不清楚的科学问题，在前期研究基础上，应用多学科方法和技术手段研究射干中异黄酮类生物合成途径的分子机制。用外源生物和非生物因子诱导，激发和强化射干悬浮培养细胞、愈伤组织和无菌苗中的异黄酮合成代谢；采用差异转录组分析和代谢组分析的方法，发现参与异黄酮合成途径关键酶的候选基因，研究其表达与异黄酮积累的相关性，筛选出最佳诱导子。对异黄酮合成下游通路的关键酶基因如异黄酮合成酶（IFS）、黄酮-6-羟化酶（F6H）、糖基转移酶（IUGTs）和氧甲基转移酶（IOMTs）基因进行克隆及序列分析，基因重组表达及蛋白功能鉴定，基因在射干和转基因植物体内的时空表达研究，阐明射干异黄酮类生物合成途径和异黄酮类化学成分多样性的分子机制。为阐释射干质量形成的生物学本质，提高药材品质、良种选育等方面具有理论意义和应用前景。

射干为治疗咽喉肿痛的要药，其富含的异黄酮是其活性成分和质控指标，其质量形成过程的分子机制之前尚不清楚。射干为鸢尾科植物，属于单子叶植物，其根茎和根中所含异黄酮的生物合成下游途径的关键酶基因未见报道。本研究综合运用分子生物学、植物代谢组学、生物信息学等原理和方法及中药生物技术等手段研究射干中异黄酮类生物合成途径和分子调控机制。通过本研究完全解析了射干中黄酮类（异黄酮）化合物从苯丙氨酸到最终产物的全部生物合成路线。对异黄酮合成下游通路的关键酶基因如异黄酮合成酶（IFS）、黄酮-6-羟化酶（F6H）、糖基转移酶（IUGTs）和氧甲基转移酶（IOMTs）基因进行了克隆及序列分析，基因重组表达及蛋白功能鉴定。以射干不同器官的转录组为基础，在筛选了29条射干P450酶基因后，找到了一条在根以及根茎中特异性表达的细胞色素P450酶基因（BcIFS），该酶能够将柚皮素直接转化为染料木素，但是该基因与豆科植物的IFS基因同源性很低，在NCBI数据库中进行比对时发现其与目前已知功能的P450酶基因的相似度均很低，表明射干的BcIFS基因很可能是在漫长的进化过程中独立进化出来的基因。射干具有的6-甲氧基异黄酮类化合物为其特征性成分，本研究通过反向遗传学的研究发现，射干的F6H基因催化芹菜素以及染料木素不受P450酶抑制剂的影响。从转录组中筛选到一条从未在植物中发现的FAD依赖的黄素单加氧酶基因，该酶进行催化作用时，需要以铁氧还原蛋白（Fdx）为递氢体，需要NADPH/NADH为氢供体进行催化反应。同时将从射干中克隆得到的Fdx以及BcF6H基因转化到酵母细胞，在酵母细胞体内可将芹菜素催化为野黄芩素，将染料木素催化为6-OH-染料木素。射干中异黄酮合成酶基因的克隆和功能验证，表明射干中的异黄酮合成关键酶基因完全不同于于豆科植物的异黄酮合成酶基因，填补了非豆科植物异黄酮生物合成关键酶研究的空白。射干中 F6H 基因的克隆和功能验证也是一项重要的创新和突破。本研究可为阐释射干质量形成的生物学本质；提高射干药材的品质、质量控制等方面提供科学依据和技术支撑，并在药用植物次生代谢工程和合成生物学等方面也可能有应用前景。

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