基于shRNA库和细胞自杀基因负向选择机制筛选新的抗乙型肝炎病毒药物靶标

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
81001459
项目类别：
青年科学基金项目
资助金额：
20.0万
负责人：
谭莉
依托单位：
中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
学科分类：
H3506.抗感染药物药理
结题年份：
2013
批准年份：
2010
项目状态：
已结题
起止时间：
2011-01-01 至2013-12-31

项目参与者：
安小平；陈知航；许先兴；侯禹男；刘大斌；曹萍；
关键词：
HBV 药物靶标筛选 shRNA文库负向筛选宿主基因

项目摘要

建立新的抗病毒药物靶标筛选系统，更为有效地筛选和鉴定新的药物靶标是抗病毒药物开发与治疗的基础。基于RNAi文库筛选病毒相关宿主基因是近年来病毒宿主基因鉴定方面的一个研究热点。本研究拟将肝特异性的随机shRNA文库筛选与tk基因的负向筛选机制相结合，建立一个以肝随机shRNA文库为基础并在全基因组范围内筛选HBV转录相关宿主基因的系统，鉴定新的与HBV转录相关的药物靶标。其原理是：用shRNA文库转染HBV转录调控模型后加入更昔洛韦（GCV)进行筛选，造成大部分细胞死亡；仅少数细胞，因外源shRNA下调HBV启动子相关调控基因的表达，导致HBV启动子转录作用被抑制，tk基因不能表达，而得以存活。一方面，本研究旨在建立抗病毒药物靶标筛选的新方法；另一方面，本研究筛选和鉴定调控基因，可以为抗HBV病毒治疗提供了潜在的靶标，相应的shRNA也可为抗HBV siRNA药物的研发提供参考。

结项摘要

建立新的抗病毒药物靶标筛选系统，更为有效地筛选和鉴定新的药物靶标是抗病毒药物开发与治疗的基础。本研究拟将随机shRNA文库筛选与tk基因的负向筛选机制相结合，建立一个以shRNA文库为基础并在全基因组范围内筛选HBV转录相关宿主基因的系统，鉴定新的与HBV转录相关的药物靶标。. 为此，本研究首先建立了pLenti-U6-shRNA和pLenti-U6-shRNA-DsRed文库。在HBV方面，我们首先构建了pEnhI/Xp-TK细胞模型，进行GCV筛选，但尽管进行了GCV浓度、GCV作用时间、细胞密度等多方面的优化和调整，我们一直没能筛选得到存活的细胞克隆，分析原因可能是TK/GCV系统在HepG2细胞中有明显的旁观者效应，在GCV作用下，tk基因表达阳性的细胞能作为效应细胞引起周边tk基因表达阴性的细胞死亡；为此，我们建立了pLenti-U6-shRNA-DsRed文库——pEnhI/Xp-EGFP细胞模型筛选系统，并利用流式细胞分选建立了分部收集的办法，对有效shRNA起到了一定的富集作用，但仍然没有达到筛选的要求，尚需要进一步的优化和调整。. 与此同时，我们构建了HIV-1 LTR-TK模型。利用pLenti-U6-shRNA文库进行GCV筛选，尽管效率不是很高，我们仍然得到了一个阳性克隆N-5，western blot证实能有效降低tk基因的表达。测序得到其中shRNA的序列为5’-GTCCTTCGCTGTGATTGTT-3’。Blast比对发现，它与功能蛋白Homo sapiens nuclear VCP-like (NVL)和Homo sapiens zinc finger protein 208 (ZNF208)都有100%的相似性。虽然对于N-5的靶基因还需要进一步的研究认证，但这部分结果也证实了“将随机shRNA文库筛选与tk基因的负向筛选机制相结合，建立一个以shRNA文库为基础并在全基因组范围内筛选病毒转录相关宿主基因的系统”方案的合理性和可行性。